诺帝对人恶性胶质瘤裸鼠原位移植瘤FPR、VEGF表达的影响及意义

作者:刘宏,卞修武,陈代伦,赵雯作者单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院病理学研究所， 重庆 400038          【摘要】  　　目的 观察诺帝对人恶性胶质瘤裸鼠原位移植瘤甲酰化肽受体 （FPR）、血管内皮生长因子 （VEGF）表达的影响，探讨其在抗胶质瘤血管生成的治疗意义。 方法 脑立体定向注射技术复制人U87胶质母细胞瘤裸鼠脑原位移植瘤模型,接种7 d后，随机分为空白对照组，生理盐水对照组和诺帝治疗组，诺帝治疗组按27 mg／kg行腹腔注射进行治疗。观察处理前后动物生存、移植瘤生长状态以及移植瘤组织病理学形态变化，分别采用间接免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜技术、免疫组织化学技术观测FPR、VEGF的表达变化。 结果 空白对照组和生理盐水组、诺帝治疗组肿瘤体积分别为 （1.040 ± 0.263） mm3、（0.880 ± 0.212） mm3和 （0.195 ± 0.054） mm3，治疗组较对照组明显缩小,抑瘤率为81.25%。三组FPR表达分别为 （57.473 ± 3.072）、（54.332 ± 1.298） 和 （40.499 ± 2.216），三组VEGF定量测定的积分光密度值 （IOD） 表达分别为 （154.763 ± 4.635）、（149.139 ± 1.494） 和 （133.784 ± 5.143），治疗组FPR、VEGF蛋白表达显著减弱 （P ＜0.05）。 结论 诺帝能降低FPR和VEGF表达了可能是抗胶质瘤血管生成作用的重要分子机制之一。

    【关键词】  神经胶质瘤； 甲酰化肽受体； 血管内皮生长因子类； 肿瘤移植

    Effects and its significance of Nordy on expression of FPR and VEGF in orthotopic implantation tumor

    of human malignant glioma-loading nude mice

    LIU Hong, BIAN Xiuwu, CHEN Dailun, et al

    Institute of Pathology, Southwest Hospital, Third Military Medical University of PLA, Chongqing 400038, China

    Abstract:  Objective  To observe the effects of Nordy, a synthetic compound, on the expression of formylpeptide receptor (FPR) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in orthotopically implanted tumor in the brain of human malignant glioma-bearing nude mice and explore the mechanism of anti-tumor effect of Nordy.  Methods  U87 glioblastoma cells were implanted into the brain of nude mice using a stereotactic technique for replicating an orthotopically implanted human glioblastoma model. After 7 days, the nude mice were randomly divided into blank control group, normal saline control group and Nordy group. Nordy (27 mg/kg body weight), a synthetic compound, was injected intraperitoneally for treatment of the implanted tumors．Living of the nude mice and growth and histopathological changes of the tumors were observed. The expressions of FPR and VEGF in the orthotopic tumor tissues were detected by immunocytochemical technique and indirect immunofluorescence staining combined with confocal laser scanning microscopy.  Results  The tumor volumes of the blank control group, normal saline control group and Nordy group were (1.040±0.263) mm3, (0.880±0.212) mm3 and (0.195±0.054) mm3 respectively. The volume of the Nordy group was statistically significantly smaller than those of the other groups. The inhibition rate of the tumor by Nordy treatment was 81.25%. The expressions of FPR in the blank control group, normal saline control group and Nordy group were (57.473±3.072), (54.332±1.298) and (40.499±2.216) respectively. The IOD of VEGF in the blank control group, normal saline control group and Nordy group were (154.763±4.635), (149.139±1.494) and (133.784±5.143) respectively. FPR and VEGF expressions in the implanted tumors decreased significantly in the treatment group (P＜0.05).  Conclusion  The inhibitory effects of Nordy on FPR and  VEGF  expression might be one of the mechanisms for its anti-cancer effects.

    Key words:  glioma;  formylpeptide receptor;  vascular endothelial growth factors;  neoplasm transplantation

    研究表明，趋化因子及其受体不仅在炎症疾病中起重要作用，而且可促进肿瘤血管生成和调控肿瘤细胞的转移[1]。甲酰化肽受体 （FPR） 是经典的化学趋化因子受体之一，在介导细胞迁移和增殖及肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用。我们自行合成的去甲二氢愈创木酸 （NDGA） 手性化合物——诺帝在既往研究中发现其不仅显著抑制体外培养的胶质瘤细胞的血管因子，而且具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和抗血管生成的效应[2，3]，但其详细的作用机制尚需进一步阐明。本研究利用人恶性胶质瘤细胞系U87裸鼠移植瘤模型，观察诺帝对移植瘤FPR和血管内皮生长因子 （VEGF） 表达的影响，探讨其在抗胶质瘤血管生成治疗中的可能意义。

    1    材料与方法

    1.1    试验材料    人恶性胶质瘤U87 （引自美国国立癌症研究所，为美国典型组织培养库细胞），新生小牛血清 （兰州民海生物制备公司），DMEM培养基 （Sigma公司），VEGF多克隆抗体 （北京中杉生物技术公司），即用型SABC检测试剂盒 （武汉Boster公司），FPR 单克隆抗体 （羊抗） （Santa Cruz公司）。

    1.2    细胞培养和瘤细胞悬液的制备　   在完全培养基中常规加入10%新生小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、3%谷氨酰胺以及适量HEPES，置于37 ℃、5% CO2混合气体孵箱中培养。取单层对数生长期细胞，胰酶消化后制成单个细胞悬液，台盼蓝拒染计数方法确保细胞活力大于90%以上，经无菌生理盐水离心、洗涤并调整细胞浓度为3 × 105个/5 μl。

1.3    诺帝溶液的配制    诺帝为我们自行研制的手性化学合成品 （纯度为99.80%），准确称取后配制成终浓度为10 mmol/L的溶液，37 ℃水浴中充分搅拌，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，装于棕色瓶中备用。

    1.4    脑内原位移植治疗试验    试验动物为无胸腺裸小鼠，近交系BALB/c nu/nu，体质量15～20 g （由第三军医大学第三附属医院野战外科研究所试验动物中心提供，许可证：fcxk，军字2002-008），SPF饲养。采用瘤细胞悬液接种方法制作动物模型，具体方法参照本组既往方法[4]：将裸小鼠麻醉后固定在鼠脑立体定位仪 （淮北正华生物有限公司），根据Baker法确定钻孔[5]位置，常规消毒铺巾，钻孔后将吸有5 μl瘤细胞悬液的微量进样器垂直插入裸小鼠脑实质中。然后随机分为：诺帝治疗组 （7只），正常对照组 （5只）、空白对照组 （6只），生理盐水对照组 （6只），接种7 d后，诺帝治疗组按27 mg／kg行腹腔注射，隔日1次，生理盐水对照组注射等体积生理盐水，空白对照组和正常对照组接种后不作任何处理。

    1.5    病理形态学检查和免疫组化染色    定期观察各组精神状态、治疗反应。在接种瘤细胞后第28天时用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后处死动物，检查肿瘤形成的部位和大小，取出脑组织后沿接种点行冠状位、连续切片，苏木精-伊红染色，测量移植瘤的最长径 （L） 和垂直最宽径 （W），并计算移植瘤的体积 （V）：V = L × W2／2。抑瘤率 = （诺帝组肿瘤体积-对照组肿瘤体积）／对照组肿瘤体积 × 100%。其余组织行冰冻切片，苏木精-伊红染色和免疫组化标记。主要步骤：3%过氧化氢-甲醇封闭内源性过氧化物酶15 min；非免疫动物血清封闭30 min；滴加VEGF一抗 （1∶200），4 ℃过夜，滴加生物素抗标记的二抗30 min和链亲和素-过氧化酶溶液30 min 。新鲜配制DAB显色，苏木精对比染核，常规设立阴性对照和阳性对照染色，选取切片后随机测定100个细胞，采用Image-Pro plus 5.0图像分析仪进行图像分析，以细胞浆内出现明确的棕黄色判定为阳性结果。测定阳性反应细胞的总面积和积分光密度 （IOD），平均光密度 （AOD） =IOD／阳性反应细胞的总面积。

    1.6    应用激光共聚显微术检测移植瘤组织FPR表达

    正常兔血清封闭30 min；加入一抗FPR （1∶80） 过夜，滴加FITC标记的兔抗羊IgG孵育2 h； 滴加碘化吡啶 （PI） 孵育5~8 min，缓冲甘油封片。常规设立阴性对照和阳性对照。在荧光显微镜下观察，以细胞胞膜上出现明确绿色荧光定为阳性结果。

    1.7    统计学分析    本组数据均以x ± s表示，并采用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析、显著性检验及配对t检验。以P ＜0.05表示差异具有显著性统计学意义，P ＜0.01表示差异具有非常显著性统计学意义。

    2    结    果

    2.1    诺帝对移植瘤生长分化和VEGF表达的影响

    除正常对照组外，各组裸小鼠在右脑尾状核形成移植瘤，肿瘤呈圆形或椭圆形，局灶性浸润生长。诺帝治疗组与空白对照组、生理盐水对照组比较，肿瘤体积明显减小。诺帝抑瘤率为81.25% （表1）。光镜下，空白对照组与生理盐水组瘤细胞丰富密集，呈圆形或短梭形，核大深染，胞浆较少，间质见丰富的微血管。诺帝治疗组瘤细胞较小、较稀疏，细梭形细胞较多，分裂像相对较少 （图1）。

    VEGF蛋白免疫组化检测可见 （图2），阳性表达呈棕黄色反应，位于瘤细胞胞浆和部分血管。空白对照组、生理盐水组和诺帝治疗组VEGF蛋白表达分别为 （154.763 ± 4.635）、（149.139 ± 1.494） 和 （133.784 ± 5.143）。结果显示诺帝显著降低了VEGF表达，其AOD与空白对照组、生理盐水组比较存在显著性差异 （P ＜0.05）。

    2.2    激光共聚显微术检测原位移植瘤组织FPR表达结果    各组均有不同程度的FPR蛋白阳性荧光表达，定位于瘤细胞的胞膜，分布呈小片状、灶性分布，染色强度不一致。空白对照组和生理盐水组显示较强的绿色荧光信号，而诺帝治疗组荧光信号明显减弱，显著降低了FPR表达 （图3）。三组FPR表达分别为 （57.473 ± 3.072）、（54.332 ± 1.298） 和 （40.499 ± 2.216），其AOD与空白对照组和生理盐水组比较，存在显著性差异 （P ＜0.05）。

    3    讨    论

    化学趋化因子受体是一类七次跨膜的G-蛋白偶联受体 （G protein-coupled receptors，GPCRs），通过对不同化学趋化因子刺激的反应而介导细胞迁移。GPCRs家族中的FPR是经典的化学趋化因子受体之一[6]，人FPR在1976年首次被发现，它是中性粒细胞表面N-甲酰化甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酰胺 （fMLF） 的高亲和力结合位点，其从分化的HL-60骨髓源性白血病细胞的cDNA文库中得以克隆。FPR与fMLF及一些宿主源性 （如来源于肿瘤细胞或其他宿主细胞线粒体） 的多肽结合，在机体的炎症反应和天然免疫进程中起重要作用。研究结果显示：功能性FPR分布于非血细胞，如肺上皮细胞、肝细胞和高度恶性人胶质瘤细胞株。FPR可参与广泛的病理生理过程，在WTO Ⅲ和Ⅳ级的恶性胶质瘤组织有FPR表达，而且FPR表达于高度恶性程度的胶质瘤细胞，而恶性程度低的胶质瘤细胞或正常人星形胶质细胞中FPR表达较少[7，8]。在坏死肿瘤细胞培养的上清液中具有FPR激动活性，提示在肿瘤的坏死区及周围受压迫的组织中，FPR受体可与宿主源性激动剂相互作用。在肿瘤细胞中，FPR可能作为感受器，感受肿瘤内部或者周围以旁分泌形式产生的激动剂，进而促进肿瘤细胞增殖、迁移和形成。因此，FPR在肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用。下调FPR的表达或抑制其功能可能是治疗恶性胶质瘤的新途径。

    血管分布丰富并伴有坏死常常是高级别胶质瘤的显著特征，这种源于肿瘤细胞异常高表达的血管生成因子，如VEGF，不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物及其抑制因子，增加血管通透性[9]。细胞在低氧环境下培养时，VEGF的mRNA水平明显升高，应用原位杂交方法分析成胶质瘤细胞组织，发现肿瘤坏死区的周围组织因缺氧而致VEGF mRNA高表达。多项试验研究证实：多种癌组织的血管密度与VEGF蛋白水平、mRNA水平密切相关。有实验发现FPR的变异体FPRL1与其激动剂LL37-hCAP-18结合，在鸡胚绒毛尿囊膜和后肢局部缺血试验中可诱导血管生成。

诺帝是一种基于天然脂氧化酶抑制剂NDGA的化学结构而合成的手性化合物，天然的NDGA具有抗氧化和抗炎效应。近年很多报道证实NDGA在体内外均具有抑制人多种肿瘤的效应。诺帝能抑制胶质瘤细胞表达VEGF及其受体KDR[10]，不仅具有显著的抗胶质瘤效应，而且可缓解大鼠糖尿病视网膜病变[11]。我们的研究结果显示：诺帝通过干扰与FPR相关的重要信号转导途径，能显著地抑制人恶性胶质瘤细胞的FPR介导的VEGF mRNA表达。因此，诺帝可能抑制FPR介导的VEGF表达，而对胶质瘤产生抗血管生成作用[2]。本试验结果显示：人U87胶质母细胞瘤裸鼠脑原位移植瘤模型能够体现脑恶性胶质瘤的生长特性和分化特征，并且胶质瘤特异性标志物GFAP弱表达，提示其高度恶化和低分化表型。诺帝治疗组的移植瘤体积明显缩小，微血管较少，而且较少出现坏死，诺帝治疗组的FPR、VEGF蛋白表达水平亦明显降低，对照组反之。并且坏死病灶周围的瘤细胞FPR往往呈强阳性表达，功能性FPR在胶质瘤细胞的表达也参与了VEGF产生的调节，从而进一步促进肿瘤血管生成。这些结果进一步拓展了我们对诺帝抗血管生成及抗肿瘤活性机制的认识。

    综上所述，诺帝对人恶性胶质瘤裸鼠脑原位移植瘤的生长具有抑制作用，而降低FPR和VEGF表达可能是诺帝抗胶质瘤血管生成作用的重要分子机制之一。诺帝显著降低FPR的蛋白水平，可能因为FPR参与了多种细胞事件。我们由此推断，诺帝抑制FPR蛋白表达可能是诺帝促进细胞分化的机制之一，也是诺帝抗肿瘤活性的机制之一。诺帝对FPR介导的这些功能均有不同程度地抑制，尤其是抑制VEGF蛋白的表达。因此，诺帝有望开发成为一种新型抗血管生成抗癌药物。

   【参考文献】    Effects and its significance of Nordy on expression of FPR and VEGF in orthotopic implantation tumor of human malignant glioma-loading nude miceLIU Hong, BIAN Xiuwu, CHEN Dailun, et alInstitute of Pathology, Southwest Hospital, Third Military Medical University of PLA, Chongqing 400038, China

     Abstract: Objective To observe the effects of Nordy, a synthetic compound, on the expression of formylpeptide receptor (FPR) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in orthotopically implanted tumor in the brain of human malignant glioma-bearing nude mice and explore the mechanism of anti-tumor effect of Nordy. Methods U87 glioblastoma cells were implanted into the brain of nude mice using a stereotactic technique for replicating an orthotopically implanted human glioblastoma model. After 7 days, the nude mice were randomly divided into blank control group, normal saline control group and Nordy group. Nordy (27 mg/kg body weight), a synthetic compound, was injected intraperitoneally for treatment of the implanted tumors．Living of the nude mice and growth and histopathological changes of the tumors were observed. The expressions of FPR and VEGF in the orthotopic tumor tissues were detected by immunocytochemical technique and indirect immunofluorescence staining combined with confocal laser scanning microscopy. Results The tumor volumes of the blank control group, normal saline control group and Nordy group were (1.040±0.263) mm3, (0.880±0.212) mm3 and (0.195±0.054) mm3 respectively. The volume of the Nordy group was statistically significantly smaller than those of the other groups. The inhibition rate of the tumor by Nordy treatment was 81.25%. The expressions of FPR in the blank control group, normal saline control group and Nordy group were (57.473±3.072), (54.332±1.298) and (40.499±2.216) respectively. The IOD of VEGF in the blank control group, normal saline control group and Nordy group were (154.763±4.635), (149.139±1.494) and (133.784±5.143) respectively. FPR and VEGF expressions in the implanted tumors decreased significantly in the treatment group (P＜0.05). Conclusion The inhibitory effects of Nordy on FPR and VEGF expression might be one of the mechanisms for its anti-cancer effects.

    Key words: glioma; formylpeptide receptor; vascular endothelial growth factors; neoplasm transplantation

    研究表明，趋化因子及其受体不仅在炎症疾病中起重要作用，而且可促进肿瘤血管生成和调控肿瘤细胞的转移[1]。甲酰化肽受体 （FPR） 是经典的化学趋化因子受体之一，在介导细胞迁移和增殖及肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用。我们自行合成的去甲二氢愈创木酸 （NDGA） 手性化合物——诺帝在既往研究中发现其不仅显著抑制体外培养的胶质瘤细胞的血管因子，而且具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和抗血管生成的效应[2，3]，但其详细的作用机制尚需进一步阐明。本研究利用人恶性胶质瘤细胞系U87裸鼠移植瘤模型，观察诺帝对移植瘤FPR和血管内皮生长因子 （VEGF） 表达的影响，探讨其在抗胶质瘤血管生成治疗中的可能意义。

    1 材料与方法

    1.1 试验材料 人恶性胶质瘤U87 （引自美国国立癌症研究所，为美国典型组织培养库细胞），新生小牛血清 （兰州民海生物制备公司），DMEM培养基 （Sigma公司），VEGF多克隆抗体 （北京中杉生物技术公司），即用型SABC检测试剂盒 （武汉Boster公司），FPR 单克隆抗体 （羊抗） （Santa Cruz公司）。

    1.2 细胞培养和瘤细胞悬液的制备　 在完全培养基中常规加入10%新生小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、3%谷氨酰胺以及适量HEPES，置于37 ℃、5% CO2混合气体孵箱中培养。取单层对数生长期细胞，胰酶消化后制成单个细胞悬液，台盼蓝拒染计数方法确保细胞活力大于90%以上，经无菌生理盐水离心、洗涤并调整细胞浓度为3 × 105个/5 μl。

 1.3 诺帝溶液的配制 诺帝为我们自行研制的手性化学合成品 （纯度为99.80%），准确称取后配制成终浓度为10 mmol/L的溶液，37 ℃水浴中充分搅拌，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，装于棕色瓶中备用。

    1.4 脑内原位移植治疗试验 试验动物为无胸腺裸小鼠，近交系BALB/c nu/nu，体质量15～20 g （由第三军医大学第三附属医院野战外科研究所试验动物中心提供，许可证：fcxk，军字2002-008），SPF饲养。采用瘤细胞悬液接种方法制作动物模型，具体方法参照本组既往方法[4]：将裸小鼠麻醉后固定在鼠脑立体定位仪 （淮北正华生物有限公司），根据Baker法确定钻孔[5]位置，常规消毒铺巾，钻孔后将吸有5 μl瘤细胞悬液的微量进样器垂直插入裸小鼠脑实质中。然后随机分为：诺帝治疗组 （7只），正常对照组 （5只）、空白对照组 （6只），生理盐水对照组 （6只），接种7 d后，诺帝治疗组按27 mg／kg行腹腔注射，隔日1次，生理盐水对照组注射等体积生理盐水，空白对照组和正常对照组接种后不作任何处理。

    1.5 病理形态学检查和免疫组化染色 定期观察各组精神状态、治疗反应。在接种瘤细胞后第28天时用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后处死动物，检查肿瘤形成的部位和大小，取出脑组织后沿接种点行冠状位、连续切片，苏木精-伊红染色，测量移植瘤的最长径 （L） 和垂直最宽径 （W），并计算移植瘤的体积 （V）：V = L × W2／2。抑瘤率 = （诺帝组肿瘤体积-对照组肿瘤体积）／对照组肿瘤体积 × 100%。其余组织行冰冻切片，苏木精-伊红染色和免疫组化标记。主要步骤：3%过氧化氢-甲醇封闭内源性过氧化物酶15 min；非免疫动物血清封闭30 min；滴加VEGF一抗 （1∶200），4 ℃过夜，滴加生物素抗标记的二抗30 min和链亲和素-过氧化酶溶液30 min 。新鲜配制DAB显色，苏木精对比染核，常规设立阴性对照和阳性对照染色，选取切片后随机测定100个细胞，采用Image-Pro plus 5.0图像分析仪进行图像分析，以细胞浆内出现明确的棕黄色判定为阳性结果。测定阳性反应细胞的总面积和积分光密度 （IOD），平均光密度 （AOD） =IOD／阳性反应细胞的总面积。

    1.6 应用激光共聚显微术检测移植瘤组织FPR表达

    正常兔血清封闭30 min；加入一抗FPR （1∶80） 过夜，滴加FITC标记的兔抗羊IgG孵育2 h； 滴加碘化吡啶 （PI） 孵育5~8 min，缓冲甘油封片。常规设立阴性对照和阳性对照。在荧光显微镜下观察，以细胞胞膜上出现明确绿色荧光定为阳性结果。

    1.7 统计学分析 本组数据均以x ± s表示，并采用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析、显著性检验及配对t检验。以P ＜0.05表示差异具有显著性统计学意义，P ＜0.01表示差异具有非常显著性统计学意义。

    2 结 果

    2.1 诺帝对移植瘤生长分化和VEGF表达的影响

    除正常对照组外，各组裸小鼠在右脑尾状核形成移植瘤，肿瘤呈圆形或椭圆形，局灶性浸润生长。诺帝治疗组与空白对照组、生理盐水对照组比较，肿瘤体积明显减小。诺帝抑瘤率为81.25% （表1）。光镜下，空白对照组与生理盐水组瘤细胞丰富密集，呈圆形或短梭形，核大深染，胞浆较少，间质见丰富的微血管。诺帝治疗组瘤细胞较小、较稀疏，细梭形细胞较多，分裂像相对较少 （图1）。

    VEGF蛋白免疫组化检测可见 （图2），阳性表达呈棕黄色反应，位于瘤细胞胞浆和部分血管。空白对照组、生理盐水组和诺帝治疗组VEGF蛋白表达分别为 （154.763 ± 4.635）、（149.139 ± 1.494） 和 （133.784 ± 5.143）。结果显示诺帝显著降低了VEGF表达，其AOD与空白对照组、生理盐水组比较存在显著性差异 （P ＜0.05）。

    2.2 激光共聚显微术检测原位移植瘤组织FPR表达结果 各组均有不同程度的FPR蛋白阳性荧光表达，定位于瘤细胞的胞膜，分布呈小片状、灶性分布，染色强度不一致。空白对照组和生理盐水组显示较强的绿色荧光信号，而诺帝治疗组荧光信号明显减弱，显著降低了FPR表达 （图3）。三组FPR表达分别为 （57.473 ± 3.072）、（54.332 ± 1.298） 和 （40.499 ± 2.216），其AOD与空白对照组和生理盐水组比较，存在显著性差异 （P ＜0.05）。

    3 讨 论

    化学趋化因子受体是一类七次跨膜的G-蛋白偶联受体 （G protein-coupled receptors，GPCRs），通过对不同化学趋化因子刺激的反应而介导细胞迁移。GPCRs家族中的FPR是经典的化学趋化因子受体之一[6]，人FPR在1976年首次被发现，它是中性粒细胞表面N-甲酰化甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酰胺 （fMLF） 的高亲和力结合位点，其从分化的HL-60骨髓源性白血病细胞的cDNA文库中得以克隆。FPR与fMLF及一些宿主源性 （如来源于肿瘤细胞或其他宿主细胞线粒体） 的多肽结合，在机体的炎症反应和天然免疫进程中起重要作用。研究结果显示：功能性FPR分布于非血细胞，如肺上皮细胞、肝细胞和高度恶性人胶质瘤细胞株。FPR可参与广泛的病理生理过程，在WTO Ⅲ和Ⅳ级的恶性胶质瘤组织有FPR表达，而且FPR表达于高度恶性程度的胶质瘤细胞，而恶性程度低的胶质瘤细胞或正常人星形胶质细胞中FPR表达较少[7，8]。在坏死肿瘤细胞培养的上清液中具有FPR激动活性，提示在肿瘤的坏死区及周围受压迫的组织中，FPR受体可与宿主源性激动剂相互作用。在肿瘤细胞中，FPR可能作为感受器，感受肿瘤内部或者周围以旁分泌形式产生的激动剂，进而促进肿瘤细胞增殖、迁移和形成。因此，FPR在肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用。下调FPR的表达或抑制其功能可能是治疗恶性胶质瘤的新途径。

     血管分布丰富并伴有坏死常常是高级别胶质瘤的显著特征，这种源于肿瘤细胞异常高表达的血管生成因子，如VEGF，不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物及其抑制因子，增加血管通透性[9]。细胞在低氧环境下培养时，VEGF的mRNA水平明显升高，应用原位杂交方法分析成胶质瘤细胞组织，发现肿瘤坏死区的周围组织因缺氧而致VEGF mRNA高表达。多项试验研究证实：多种癌组织的血管密度与VEGF蛋白水平、mRNA水平密切相关。有实验发现FPR的变异体FPRL1与其激动剂LL37-hCAP-18结合，在鸡胚绒毛尿囊膜和后肢局部缺血试验中可诱导血管生成。

  诺帝是一种基于天然脂氧化酶抑制剂NDGA的化学结构而合成的手性化合物，天然的NDGA具有抗氧化和抗炎效应。近年很多报道证实NDGA在体内外均具有抑制人多种肿瘤的效应。诺帝能抑制胶质瘤细胞表达VEGF及其受体KDR[10]，不仅具有显著的抗胶质瘤效应，而且可缓解大鼠糖尿病视网膜病变[11]。我们的研究结果显示：诺帝通过干扰与FPR相关的重要信号转导途径，能显著地抑制人恶性胶质瘤细胞的FPR介导的VEGF mRNA表达。因此，诺帝可能抑制FPR介导的VEGF表达，而对胶质瘤产生抗血管生成作用[2]。本试验结果显示：人U87胶质母细胞瘤裸鼠脑原位移植瘤模型能够体现脑恶性胶质瘤的生长特性和分化特征，并且胶质瘤特异性标志物GFAP弱表达，提示其高度恶化和低分化表型。诺帝治疗组的移植瘤体积明显缩小，微血管较少，而且较少出现坏死，诺帝治疗组的FPR、VEGF蛋白表达水平亦明显降低，对照组反之。并且坏死病灶周围的瘤细胞FPR往往呈强阳性表达，功能性FPR在胶质瘤细胞的表达也参与了VEGF产生的调节，从而进一步促进肿瘤血管生成。这些结果进一步拓展了我们对诺帝抗血管生成及抗肿瘤活性机制的认识。

    综上所述，诺帝对人恶性胶质瘤裸鼠脑原位移植瘤的生长具有抑制作用，而降低FPR和VEGF表达可能是诺帝抗胶质瘤血管生成作用的重要分子机制之一。诺帝显著降低FPR的蛋白水平，可能因为FPR参与了多种细胞事件。我们由此推断，诺帝抑制FPR蛋白表达可能是诺帝促进细胞分化的机制之一，也是诺帝抗肿瘤活性的机制之一。诺帝对FPR介导的这些功能均有不同程度地抑制，尤其是抑制VEGF蛋白的表达。因此，诺帝有望开发成为一种新型抗血管生成抗癌药物。