钾离子通道激动剂对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的作用

作者:梁捷,史继新,黄新,印红霞   作者单位：. 南京大学医学院临床学院， 江苏 南京 210002； 中国人民解放军南京军区南京总医院 2. 神经外科； 3. 病理科， 江苏 南京 210002        【摘要】  　　目的 观察早期使用不同剂量特异性钾离子通道激活剂对蛛网膜下腔出血 （SAH） 后脑血管痉挛 （CVS） 的作用。 方法 将24只雄性新西兰白兔随机等分为4组：①对照组：枕大池注入生理盐水；②SAH组；③SAH +小剂量钾离子通道激活剂Cromakalin组 （0.1 mg/kg）；④SAH +大剂量Cromakalin组 （0.3 mg/kg）。采用枕大池注血法建立兔SAH模型，1 h后开始静脉输注Cromakalin，每12 h给药1次，共4次。注血后48 h采用灌注固定法处死动物动物，留取基底动脉标本，通过测定基底动脉血管横截面积来评价CVS的程度。 结果 基底动脉横截面积测定的结果提示SAH组较对照组明显缩小 （P ＜0.01），而SAH＋小剂量Cromakalin组及SAH +大剂量Cromakalin组均较SAH组痉挛明显改善 （P ＜0.05）。 结论 早期使用特异性钾离子通道激活剂Cromakalin能改善兔SAH模型的基底动脉血管痉挛。

   【关键词】  蛛网膜下腔出血； 血管痉挛，颅内； 钾通道

    Effect of potassium channel activator on cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage

    LIANG Jie1,2, SHI Jixin2, XIE Wei2, et al

    1. Clinical College of Nanjing University, Nanjing 210093;  2. Department of Neurosurgery, General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Nanjing 210002, China

    Abstract:  Objective  To observe the effect of early different doses of specific potassium channel activator on cerebral vasospasm (CVS) after subarachnoid hemorrhage (SAH).  Methods  Twenty-four female New Zealand White rabbits were equally randomized to four groups: ①control with injection of normal saline to the cisterna magna, ② subarachnoid hemorrhage (SAH), ③ SAH treated with low-dose (0.1 mg/kg) cromakalim (a specific potassium channel activator), ④ SAH treated with high-dose (0.3 mg/kg) cromakalim. The rabbit SAH model was constructed by autologous blood injection into the cisterna magna. Cromakalim (0.1 or 0.3 mg/kg) was injected intravenously at 12-hour intervals beginning 1 hour after the SAH. The animals were sacrificed by perfusion-fixation and the basilar artery was taken 48 hours after the blood-injection in vivo. The cross-sectional area of each basilar arterial lumen was measured to evaluate the degree of CVS.  Results  The cross-sectional area of arterial lumen in SAH group was statistically significantly smaller than that of the control group (P<0.01), and treatment with cromakalim significantly attenuated SAH-induced vasospasm (P<0.05).  Conclusion  Early use of specific potassium channel activator can attenuate the CVS after experimental SAH in rabbits.

    Key words:  subarachnoid hemorrhage;  vasospasm, intracranial;  potassium channels        脑血管痉挛 （CVS） 是蛛网膜下腔出血 （SAH） 后致死、致残率高的主要原因之一，其机制目前尚不明确。目前钾离子通道激动剂已被成功运用于临床治疗冠状动脉痉挛，但其是否可在SAH后有效改善CVS并发挥脑保护作用，以及细胞中钾离子通道与钙离子通道的级联反应关系，均是颇受关注的研究课题。本研究旨在观察早期使用不同剂量特异性钾离子通道激动剂能否有效缓解SAH后的CVS。

    1    材料与方法

    1.1    试验动物及试剂    24只雄性新西兰白兔 （江苏省实验动物中心提供），体质量2.8~3.2 kg，随机等分为4组：①对照组：枕大池注入生理盐水；②SAH组；③SAH +小剂量 （0.1 mg/kg） 钾离子通道激活剂组Cromakalin （Sigma公司）；④SAH +大剂量 （0.3 mg/kg） Cromakalin组。

    1.2    SAH模型的建立    采用枕大池注血方法建立SAH模型[1]。动物麻醉采用肌注氯氨酮 （25 mg/kg） 和氟哌利多 （1.0 mg/kg）。兔侧卧位，用7号腰穿针经皮穿刺枕大池，按照0.5 ml/kg放出脑脊液后从兔耳中心动脉抽取2.5 ml动脉血缓慢注入枕大池，一般1 min左右，需防止注射过慢致血液凝固。注射完毕拔针后，把兔子置于30°头低位约30 min。然后放入一个安静、干燥的纸箱内，待其麻醉完全清醒。

    1.3    试剂及药物的注入    枕大池注血后1 h开始给药，剂量及给药方式根据此药物在心血管系统动物实验中报道的使用经验[2]。实验组分别给予0.1 mg/kg和0.3 mg/kg Cromakalin，每个实验动物所用试剂精确称量后再用生理盐水配制成5 ml，通过兔耳缘静脉缓慢输注，12 h给药1次，共4次 （SAH模型建立后1 h、12 h、24 h、36 h）。对照组及SAH组以同样方式注入等量生理盐水。

    1.4    活体灌注    SAH模型建立48 h后，肌注氯氨酮 （25 mg/kg） 和氟哌利多 （1.0 mg/kg） 再次麻醉白兔。然后将白兔仰卧位固定于手术台上，行气管切开并插管 （口径3.5 mm），用小动物呼吸机 （江西特力麻醉呼吸设备有限公司） 辅助呼吸。在耳中心动脉置入22号套管针 （BD，中国苏州），接心电监护仪 （Spacelabs Medical，美国），作术中平均动脉压 （MAP） 和心率 （HR） 监测。活体灌注按照文献报道的方法进行[3]。灌注完毕后开颅取出脑标本，浸入10%甲醛溶液中。

    1.5    标本制作及组织学评价    经10%甲醛溶液固定的脑及血管组织用石蜡包埋，在每个基底动脉的近、中、远段中点取材，每点连续取3个切片，层厚4 μm。切片经苏木精－伊红染色后，采用高分辨率医学图像分析系统 （HMIAP－2000，同济医科大学开发） 测定每个切片中血管周长，然后换算成标本横截面积，计算9张切片平均横截面积作为该兔的基底动脉管腔面积[3]。1.6    统计分析    使用SPSS 11.0统计软件。基底动脉横截面积用x ± s表示，采用方差分析 （One Way ANOVA），以P ＜0.05为有显著性差异。

    2    结    果

    2.1    大体观察    四组标本在肉眼下进行观察比较，对照组标本未见凝血块 （图1），而在其余三组标本的脑桥及延髓表面均可见到凝血块，且颅底双侧颞叶底面有明显的血迹 （图2）。

    2.2    各组基底动脉横截面积    对照组为 （686143.1 ± 64150.2） μm2；SAH组中 （286483.7 ± 78795.6） μm2；SAH + 小剂量 （0.1 mg/kg） Cromakalin组 （423378.1 ± 54393.1） μm2；SAH + 大剂量 （0.3 mg/kg） Cromakalin组 （566821.9 ± 89328.2） μm2。方差分析结果：①SAH组较对照组血管面积明显减少 （P ＜0.01）；②SAH + 小剂量 （0.1 mg/kg） Cromakalin组与SAH组比较，血管痉挛有缓解 （P ＜0.05）；③SAH + 大剂量 （0.3 mg/kg） Cromakalin组与SAH组比较，血管痉挛明显缓解 （P ＜0.05），但与对照组比较仍有缩小 （P ＜0.05），其与SAH + 小剂量Cromakalin组比较也有统计学差异 （P ＜0.05） （图3~5）。

    3    讨    论

    在CVS的机制探索中，离子通道的研究由于具有较高的临床意义一直占据着重要地位，近年来继钙离子通道之后，钾离子通道渐渐成为研究热点[4]。钾离子通道是迄今发现的在体内分布最广泛、亚型最多、作用最复杂的一类离子通道，一般将钾离子通道分为四种基本类型：①电压门控型钾离子通道；②钙离子激活型钾离子通道；③配体门控型钾离子通道；④第二信使-细胞内代谢物门控型钾离子通道。其中在血管舒缩调控领域研究的热点是ATP敏感性钾离子通道，即KATP通道[5]。KATP通道是一组将细胞膜电活动与细胞代谢联系在一起的重要离子通道，参与细胞膜电位与细胞内代谢信息传递，并与神经细胞膜超极化、神经递质释放、激素分泌、血管扩张、骨骼肌兴奋性等功能有关。这是一种对钾离子具有高度选择性呈较弱的内向整流性通道，其有两个显著的药理学特性：能被磺酰脲类复合物抑制和被多种钾离子通道开放剂激活[6]。钾离子通道调控剂包括钾离子通道阻滞剂和钾离子通道开放剂，通过阻滞或促进细胞内钾离子外流而产生各种药理作用。

    近年来，对脑血管中钾离子通道以及通道调控剂已有不少学者进行了深入研究并获得了一些突破。Aibara等[7]采用RT-PCR和免疫印迹等分子生物学技术检测狗模型基底动脉中离子通道的mRNA和蛋白表达情况，发现SAH后CVS发生时电压门控型钾离子通道和钙离子激活型钾离子通道表达明显下调，钾离子通道的表达抑制在引起CVS中起着重要作用。Sobey[8]指出SAH后脑血管平滑肌中血管舒张功能失常的原因包括钾离子通道以及NO-cGMP作用链的异常状态。Zccarello等[9]报道Cromakalim可以选择性地激动KATP通道从而逆转SAH导致的平滑肌细胞的去极化从而缓解痉挛。Kwan等[10，11]的实验也证实SAH后早期和晚期使用Cromakalim对CVS均有一定缓解作用。虽然关于Cromakalim发挥作用的钾离子通道的类型还需要通过继续研究以精确辨认，但以前的相关实验成果以及本实验均已基本验证了钾离子通道激动剂在改善CVS方面具有治疗意义这一理论，其作用机制为：使用钾离子通道激活剂激活钾离子通道可使钾离子电导增强，细胞膜超极化，兴奋性降低，间接引起电压门控型钾离子通道关闭，胞浆内钙离子减少，平滑肌张力减低，血管扩张，部分逆转SAH诱发的CVS。

    本组试验选用白兔制造SAH后CVS模型，是因为试验方法相对简单且模型效果满意，SAH组标本显示枕大池一次注血48 h后肉眼观察基底动脉周围蛛网膜下腔内血凝块沉积，苏木精-伊红染色显示痉挛的基底动脉上出现明显的内膜皱褶，平滑肌细胞肥大、坏死，外膜变厚，并出现炎症细胞浸润的病理变化，类似临床上人SAH。另外，由于兔颅内、外循环之间没有丰富的血管网沟通，其血管类型比猫、狗更接近于人[12]。传统的血管舒张药对兔CVS同样效果欠佳，说明此动物模型能够模拟人SAH。使用特异性钾离子通道激活剂后，尽管血管横截面积与SAH组比较明显改善，与对照组比较仍有统计学差异，提示离子通道活动只是SAH后CVS发生机制的一个方面，CVS是多种因素共同作用的结果，需要进行更深入的研究。

【参考文献】  [1] MEGYESI J F, VOLLRATH B, COOK D A, et al. In vivo animal models of cerebral vasospasm: a review [J]. Neurosurgery, 2000, 46(2): 448-461.

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[9] ZCCARELLO M, BONASSO C L, LEWIS A I, et al. Relaxation of subarachnoid hemorrhage-induced spasm of rabbit basilar artery by the K+ channel activator cromakalim [J]. Stroke, 1996, 27(2): 311-316.

[10] KWAN A L, LIN C L, YANAMOTO H, et al. Systemic administration of the potassium channel activator cromakalim attenuates cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage [J]. Neurosurgery, 1998, 42(2): 347-351.

[11] KWAN A L, LIN C L, WU C S, et al. Delayed administration of the K+ channel activator cromakalim attenuates cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage [J]. Acta Neurochir (Wien), 2000, 142(2): 193-197.

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