三氧化二砷脂质体的制备及其对鼠脑胶质瘤的影响

作者:张旭,赵世光,任颖,宋大勇

    《中国微侵袭神经外科杂志》2007年6月12卷6期 文章     作者单位：1. 哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150001； 2. 黑龙江省第二医院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150001； 3. 哈尔滨医科大学附属第四医院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150001    【摘要】  目的 研究三氧化二砷 （As2O3） 脂质体注射液对大鼠体内C6胶质瘤细胞凋亡的影响。 方法 采用超声薄膜分散法制备As2O3脂质体，将126只成瘤大鼠分为As2O3脂质体组、As2O3组、生理盐水组。原子荧光法检测注射As2O3脂质体和As2O3后大鼠脑组织中As2O3浓度。从电镜、TUNNEL和大鼠生存时间等方面研究As2O3脂质体对C6胶质瘤的影响。 结果 As2O3脂质体提高了As2O3的血-脑屏障通过。电镜和TUNEL检测显示：As2O3脂质体组细胞凋亡率给药后3 d为 （13.53 ± 1.68）%，7 d为 （20.03 ± 0.79）%，多于As2O3组和盐水组。动物生存时间亦优于其他两组。 结论 超声薄膜分散法是制备As2O3脂质体的较好方法。As2O3脂质体可较As2O3更明显地诱导鼠脑胶质瘤细胞凋亡，延长载瘤鼠的生存期。

   【关键词】  砷剂 脂质体 神经胶质瘤 细胞凋亡

    Preparation and effects of arsenic trioxide liposome on glioma cell apoptosis in rats

    ZHANG Xu1, ZHAO Shiguang1, REN Ying2, et al

    1. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China;  2. Department of Neurosurgery, the Second Hospital of Heilongjiang Province, Harbin 150001, China

    Abstract:  Objective  To develop the injection of liposome-encapsulated arsenic trioxide (As2O3 liposome) and investigate the effects of As2O3 liposome on C6 glioma cell apoptosis in tumor-bearing rats.  Methods  The liposomes were developed by ultrasonic wafer dispersion. The tumor-bearing rats (126 rats) were equally randomized into As2O3 liposome group, As2O3 group and saline group and injected intravenously with above 3 kinds of medicine respectively. As2O3 concentration was measured by using atomic fluorescence technique in As2O3 liposome group and As2O3 group. The effects of As2O3 liposomes on C6 glioma cells in the three groups were studied by electronic microscopy, TUNNEL staining and survival time.  Results  As2O3 liposomes obviously facilitated BBB penetration of As2O3. The electronic microscopic analysis and TUNNEL staining results showed tumor cell apoptosis rate was 13.53±1.68% on the 3rd day and 20.03±0.79% on the7th day after drug injection in As2O3 liposome, much higher than those of As2O3 group and saline group. The survival time was also much longer in As2O3 liposome group than in the other two groups.  Conclusion  Ultrasonic wafer dispersion is a good method for developing As2O3 liposomes. The As2O3 liposomes can more significantly induce apoptosis of glioma cells and prolong the life span of glioma-bearing rats than As2O3 alone.

    Key words:  arsenicals;  liposomes;  glioma;  apoptosis      

  三氧化二砷 （As2O3） 可能是一种有效的新型抗脑肿瘤药物[1]。但其血-脑屏障 （BBB） 的透过率低，故鞘外给药难以在脑组织中达到有效的治疗浓度[2]。本实验通过超声薄膜分散法将As2O3包封成脂质体性药物，提高了As2O3在鼠脑内的药物浓度，并进一步研究了As2O3脂质体对大鼠脑胶质瘤凋亡的影响。

    1    材料与方法

    1.1    材料与试剂    大鼠C6脑胶质瘤细胞株 （日本关西医科大学）、Wistar雄性大鼠 （体质量200～250 g，哈医大一院动物中心）、注射级大豆卵磷脂EPC （太伟药业公司），胆固醇、维生素E粉 （Sigma 公司），亚砷酸注射液 （伊达制药）。

    1.2    主要仪器    RE-52AAB旋转蒸发器、ZKJ-1型循环水式多用真空泵 （上海嘉鹏公司），JY92-2D型超声波细胞粉碎机 （浙江），AFS-930双道原子荧光光度仪 （吉天仪器公司），倒置相差显微镜 （OLYMPUS，IX70-S8F），透射电子显微镜 （JEN-M1220），荧光显微镜 （德国，Zeiss Axioskop），1.5T磁共振机 （东芝1.5TVISRT型）。

    1.3    As2O3脂质体的制备    将卵磷脂、胆固醇、维生素E粉按20∶5∶1的浓度溶于适量氯仿中，40 ℃真空旋转拉膜至无氯仿味，待用。然后将As2O3溶于PBS溶液，浓度1 mg/ml，取该溶液10 ml和数枚小玻璃珠一并加入磷脂和胆固醇的混合液中，旋转水化15 min，制成粒径较大 （3~6 μm）、不均一的大多层脂质体；应用冰浴超声，可获得粒径为0.25～1 μm的单室As2O3脂质体。

    1.4    As2O3脂质体包封率的检测

    1.4.1    砷标准曲线的建立：    分别量取标准砷溶液0、4、8、12、16、24 ml置于砷化氢发生器中，加入盐酸5 ml，以去离子水补充至50 ml，再加入碘化钾试液5 ml和酸性氯化亚锡试液5滴，室温放置10 min，加入锌粒2 g，然后接上装有醋酸铅棉导管的瓶塞，通入装有5 ml二已基二硫代氨基甲酸银 （DDC-Ag） 溶液的吸收管中。将砷化氢发生器置于35 ℃水浴中反应60 min后，以DDC-Ag溶液为空白溶液，在504 nm处测定吸收度，以吸收度 （A） 为纵坐标，浓度 （C） 为横坐标，进行线性回归，得回归方程：A = 0.0325，C－0.0109，r = 0.9998，线性范围4～24 μg/ml[3，4]。

    1.4.2    载药脂质体包封率的测定：    精密吸取As2O3脂质体注射液0.5 ml，采用凝胶层析法[3]分离脂质体和游离药物，依照1.4.1的方法分别测定脂质体中As2O3总含量和已被包封的含量，按下式计算：E% = C1／C2 × 100% （E%：脂质体包封率，C1：包封在脂质体中的砷浓度，C2：脂质体溶液中总的砷浓度）。

1.5    双道原子荧光法检测大鼠脑组织砷含量    Wistar雄性大鼠126 只，随机均匀分为3组，分别静脉注射As2O3脂质体、As2O3注射液和生理盐水，注射剂量为2 mg·kg－1·d－1。分别在给药后0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h，每组随机抽取6只大鼠，取脑组织，应用双道原子荧光法检测鼠脑中的砷含量。

    1.6    建立载瘤动物模型    建立大鼠脑胶质瘤模型[5]。7 d时行MRI检查成瘤情况，取肿瘤位置及生长情况比较一致的大鼠54只，随机分为生理盐水组、As2O3组、As2O3脂质体组，分别静脉注射上述药物，1次／d，连续给药7 d。观察大鼠的生存状态，用药后第3、7天每组分别随机处死6只大鼠，留取标本，剩余大鼠观察存活时间。

    1.7    电镜观察和凋亡检测    把鼠脑胶质瘤组织以2%戊二醛固定，制作标本，透射电镜观察亚细胞结构。按照Roche公司原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，细胞核内棕褐色染色为阳性细胞，每张切片随机选择5个视野，两人双盲高倍镜下计数500个细胞中的阳性细胞数，取均值，以x ± s表示。

    1.8    统计学处理    采用SAS.9.1.3统计学软件，对大鼠脑组织的砷含量及电镜观察和凋亡检测的数据进行方差分析，并做两两比较；对载瘤动物模型数据进行Kaplan-Meier分析，绘制生存曲线，并做log-rank检验。

    2    结    果

    2.1    载药脂质体包封率 （表1）    经本法制备的脂质体包封率达到2002版药典的标准[3]。

    2.2    大鼠脑组织中砷含量检测 （表2）    7个时间点所测得的大鼠脑组织的砷浓度，As2O3脂质体组均高于单纯As2O3组和盐水组 （P ＜0.01），说明经脂质体包封可促进As2O3进入血-脑屏障。

    2.3    肿瘤组织透射电镜观察 （图1）    As2O3脂质体组有较多细胞呈凋亡改变，肿瘤中心及周边部均较多； As2O3组和盐水组凋亡细胞较少，后两组凋亡细胞多存在于肿瘤中心，周边部较少。

    2.4    TUNEL法凋亡检测 （图2）    给药后3 d和7 d，盐水组阳性染色率分别为 （3.15 ± 0.34）%和 （3.92 ± 0.57）%，As2O组分别为 （3.18 ± 0.41）%和 （4.09 ± 0.54）%，而As2O3脂质体组阳性染色率达到 （13.53 ± 1.68）%和 （20.03 ± 0.79）%。As2O3脂质体组阳性染色率高于As2O组和盐水组 （P ＜0.01）。在As2O3脂质体组中，给药7 d的肿瘤组织阳性染色细胞数大于给药3 d者 （P ＜0.01），可见As2O3诱导凋亡有明显的时间依赖性。

    2.5    大鼠生存期 （图3）    生理盐水组 （n = 6） 中位生存时间是20 d，As2O3组 （n = 6） 中位生存时间是23 d。As2O3脂质体组 （n = 6） 的大鼠直至58 d时死亡1只，剩余5只 （在70 d时处死），其中3只大鼠的大脑切片未见肿瘤，2只大鼠脑内仍有肿瘤存在，但与盐水组和As2O3组相比，As2O3脂质体组的生存期明显延长 （P ＜0.01）。

    3    讨    论

    脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的33.3%～58.9%[6]。因此，探索有效的脑胶质瘤治疗新方法已成为迫切的课题。体外实验已证实As2O3以剂量依赖的方式将细胞周期俘获于G2-M期，并以诱导胶质瘤细胞凋亡来抑制U87MG和T98G细胞的增殖[1]。但As2O3对血-脑屏障的通透率低，难以对颅内肿瘤起到治疗作用，成为临床应用研究的障碍，所以脂质体载药系统为砷剂的活体应用研究提供了一个新途径。

    脂质体是由磷脂双层构成的、具有水相内核的脂质微囊，作为抗癌药物载体有很多优点：对癌细胞的靶向性，血液中存留时间长，毒副作用低，药效高等，且具有生物降解性和生物相容性。脂质体通过延缓药物代谢和清除，降低药物分布体积 ,有利于向病变组织分布，可提供持续的药物释放[7]。1个 0.10 μm的脂质体分子可包裹约10 000个药物分子，所以脂质体可显著地增加药物在脑部的转运量[8]，其包封药物后形成脂质膜，较单体药物分子易于透过BBB，可产生脑靶向作用，提高了脑内药物浓度。将As2O3制成单层脂质体，粒径为0.25～1 μm，不易被巨噬细胞清除。经静脉给药，释放动力学类似于溶液系统，脂质体可作为 As2O3的贮藏库。本实验采用双道原子荧光法检测证实：As2O3脂质体组大鼠脑组织砷含量明显高于单纯As2O3注射组，增加药物有效作用时间。

    我们制备As2O3脂质体应用薄膜分散法，相比于单室脂质体的制作具有简便、实用的特点，只要药物的pH值适当，可获得较大的包封率，适合研究需要。如果应用冻融技术和前体脂质体技术，则可提高脂质体的稳定性。所以应用As2O3脂质体提高了As2O3对BBB的透过性。

    凋亡是由内外环境变化或死亡信号触发，在相关基因调控下引起的细胞主动死亡过程，其是抗肿瘤药物发挥治疗作用的重要机制。胶质瘤细胞对化疗药物诱导凋亡敏感[9]。从本实验大鼠脑胶质瘤组织电镜切片可见在As2O3脂质体组中，胶质瘤细胞结构出现了一系列细胞凋亡的典型变化，而在As2O3组和盐水组除了肿瘤中心坏死区外，几乎很少有凋亡改变的胶质瘤细胞存在。故单纯应用As2O3，不能有效地透过BBB而发挥对脑胶质瘤的治疗作用，而As2O3脂质体能更好地透过BBB，提高脑内As2O3的浓度，发挥其诱导胶质瘤细胞凋亡的作用。原位凋亡检测结果进一步证实了As2O3脂质体能有效地诱导胶质瘤细胞凋亡，并且As2O3脂质体组在用药后第3、7天分别得到 （17.53 ± 0.68）%和 （25.03 ± 0.49）%的阳性率，明显优于其他两组，差异具有统计学意义 （P ＜0.01）；As2O3脂质体组第7天的采样检测结果亦优于同组第3天 （P ＜0.01）。以上结果均证实As2O3脂质体可使更多的As2O3进入BBB，诱导胶质瘤细胞凋亡，并具有明显的剂量-时间依赖性关系，与体外研究结果一致[1]。

 但As2O3可对正常脑组织产生损害，其毒性作用与脑组织内As2O3量呈正相关，因此实验应用的As2O3剂量需控制在安全范围之内。As2O3的药物代谢动力学以及局部脑组织中As2O3最适宜的治疗浓度尚不清楚，这将是我们今后研究的重点。As2O3脂质体可能为As2O3治疗脑胶质瘤提供一种可行、有效的途径。

【参考文献】  [1] 赵世光, 李力仙, 张建华, 等. As2O3对不同p53表型的人胶质瘤细胞系细胞周期蛋白B1，D1表达的影响 [J]. 中华神经外科杂志, 2004, 20(3): 202-206.

[2] LING Y H, JIANG J D, HOLLAND J F, et al. Arsenic trioxide produces polymerization of microtubules and mitotic arrest before apoptosis in human tumor cell lines [J]. Mol Pharmacol, 2002, 62(3): 529-538.

[3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部) [S]. 北京:化学工业出版社，2005: 附录51-53.

[4] 华海清, 秦叔逵. 氢化物发生—原子荧光光谱法测定血浆样品中砷浓度的方法学研究 [J]. 临床肿瘤学杂志, 2005, 10(4): 350-352.

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