Abelson相关基因和皮层蛋白在大肠癌中的表达及其临床意义

　　【摘要】目的探讨Abelson相关基因(Arg)和皮层蛋白(Cortactin)在人大肠癌组织中的表达及其意义。方法通过免疫组织化学染色法检测80例大肠腺癌组织、30例大肠腺瘤组织及30例癌旁结肠组织中Arg和Cortactin的表达及其相互关系。结果　Arg和Cortactin阳性表达在大肠腺癌组织中为70%和67.5%，均显著性高于癌旁结肠组织(0和0)和大肠腺瘤组织(0和0)。Arg和Cortactin表达与肿瘤分化程度和Dukes分期均显著相关(P<0.05);Arg和Cortactin高表达生存期低(P<0.05)，与患者年龄、性别无关(P>0.05);Arg和Cortactin在大癌组织中表达有相关性(P<0.01)。结论　Arg和Cortactin可能参与了肿瘤生长和发展的共同通道，在大肠癌的发生、发展和转移过程中起着重要作用。

　　【关键词】 结直肠肿瘤;　基因，abl;　皮层蛋白

　　【Abstract】　Objective　To explore the expression of Arg and Cortactin in human colorectal cancer tissues.Methods　The expressions of Arg and Cortactin in colorectal tissue specimens were determined by immunohistochemistry(two step method) in 80 cases of human colorectal adenocarcinomas,30 colorectal adenomas and 30 colorectal tissue adjacent to adenocarcinomas.Results　The positive rates of Arg and Cortactin in the adenocarcinomas，adenomas and colorectal tissue adjacent to adenocarcinomas were 70%,0,0;67.5%,0,0，respectively，expression of Arg and Cortactin in the adenocarcinomas were higher than that of colorectal tissue adjacent to adenocarcinomas and colorectal adenomas (P<0.001).There was a statistically significant correlation of Arg and Cortactin expression with tumor cell differentiation and Dukes stage (P<0.01).Higher Arg and Cortactin immunostaining scores were associated with higher mortality(P<0.05).There was no statistically correlation of Arg expression with the age and gender (P>0.05).Conclusions　Arg and Cortactin take place in common pathways in tumor development progression and metastasis.And they play an important role in colorectal carcinomas.

　　【Key words】　Colorectal neoplasms;　Genes，abl;　Cortactin

　　大肠癌是主要的消化道恶性肿瘤，其发病率在我国逐年上升。近来的研究发现，与所有的恶性肿瘤一样，在结肠癌浸润和转移过程中，细胞的内吞作用发挥重要作用，细胞内吞作用与细胞内肌动蛋白骨架有关。最近有研究表明，皮层蛋白(Cortactin)，Abelson(Abl)家族激酶，包括脊椎动物Abl/Abl1和Abl相关基因(Abl-related gene，Arg)/Abl2蛋白质，是细胞骨架重排的重要介质，促进细胞运动。本研究通过免疫组织化学方法检测Cortactin和Arg在癌旁大肠组织、大肠腺瘤及大肠腺癌中表达，以探讨其在肿瘤发生中的相互作用及其与临床病理因素之间的相互关系。

　　资料与方法

　　1. 一般资料：80例大肠癌标本随机选自南通大学附属医院2003年2月至2005年2月行外科手术切除的大肠腺癌患者，其中男53例，女27例，年龄(61.5±15.4)岁。另外选取同期大肠癌旁正常组织标本30例和大肠腺瘤标本30例作为对照。患者手术前均未行新辅助放、化疗。所有标本均经HE切片证实。

　　2. 病理学资料：80例大肠癌标本中肿瘤高分化18例，中分化48例，低分化14例。80例大肠癌标本Dukes分期，A期6例，B期34例，C期35例，D期5例。

　　3. 主要试剂：兔抗人Arg多克隆抗体(H-300)购自SANTA CRUZ生物技术公司，兔抗人Cortactin多克隆抗体(H-191)购自SANTA CRUZ生物技术公司，SP即用型免疫组织化学检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

　　4. 大肠癌组织、大肠癌旁正常组织和大肠腺瘤中Arg和Cortactin表达的检测：手术切除标本经10%中性甲醛溶液固定后取材，常规石蜡包埋、切片。采用免疫组织化学SP法。具体步骤：石蜡组织行4 μm厚度连续切片，经常规脱蜡水化后，将切片置于柠檬酸盐缓冲液中加热至100 ℃进行抗原热修复10 min，然后每张切片滴加50 μl过氧化物酶溶液阻断内源性过氧化物酶活性，室温下培育10 min，PBS洗涤3次，3 min/次;弃去PBS，在每张切片上滴加50 μl非免疫动物血清进行非免疫性动物血清保护，室温培育10 min;弃去血清，每张切片滴加50 μl(1∶100稀释)兔抗人Arg多克隆抗体(H-300)和兔抗人Cortactin多克隆抗体(H-191)作为一抗，4 ℃反应过夜，PBS洗涤3次，5 min/次;弃去PBS，每张切片滴加50 μl生物素标记的二抗，室温培育10 min，PBS洗涤 3次，3 min/次;弃去PBS，每张切片滴加50 μl链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下培育10 min，PBS洗涤3次，3 min/次;弃去PBS，每张切片滴加100 μl DAB显色溶液进行显色，苏木精复染，0.1%盐酸乙醇分化，0.1%氨水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，在光学显微镜下观察。阴性对照以PBS代替一抗，以正常扁桃体组织作为阳性对照。

　　5. 阳性结果判断：由两位经验丰富的病理科医师以双盲法阅片。免疫组织化学染色显示，Arg、Cortactin主要表达于细胞质-膜，呈棕黄色或棕褐色。记分标准基于3个参数的半定量计数方法，即染色强度、阳性细胞的百分率和前两者记分的乘积，0分为阴性表达，1～2分为低表达(+)，>2分为高表达(++)。

　　6. 统计学分析：运用SPSS 17.0软件进行数据处理，Arg与Cortactin表达与患者临床病理特征的关系采用χ2检验，联合分析采用线性相关关系分析，P<0.05为差异有统计学意义。绘制Kaplan-Merier生存曲线，生存期的比较采用Log-rank检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　结　　果

　　1. 大肠癌组织中Arg和Cortactin的表达：免疫组织化学法检测结果显示，Arg和Cortactin在大肠癌组织中有不同程度的表达，阳性染色定位于细胞质-膜。80例大肠癌组织中有56例(70%)Arg阳性表达，而癌旁正常结肠组织和大肠腺瘤中Arg均为阴性表达。80例大肠癌组织中有54例(67.5%)Cortactin阳性表达，而癌旁正常结肠组织和大肠腺瘤中Cortactin均为阴性表达。大肠癌中Arg和Cortactin高表达、低表达和阴性表达的典型样本见图1。

　　2. 大肠癌组织中Arg的表达与患者临床病理特征的关系(表1)：大肠癌组织中Arg表达水平与患者的年龄、性别无关(P>0.05)，Arg表达与肿瘤分化程度和Dukes分期有关(P<0.001)，Arg高表达生存期低(P<0.01)。

　　3. 大肠癌组织中Cortactin的表达与患者临床病理特征的关系(表1)：大肠癌组织中Cortactin表达水平与患者的年龄、性别无关(P>0.05)，Cortactin表达与肿瘤分化程度和Dukes分期有关(P<0.05)，Cortactin高表达生存期低(P<0.05)。　表1　大肠癌组织中Arg及Cortactin表达与患者临床病理特征的关系

　　4. 生存期：(1)大肠癌组织中Arg阴性表达、低表达、高表达患者平均生存期分别为(55.000±2.192)个月、(43.417±3.234)个月、(37.813±3.679)个月，随着Arg表达阳性的增高生存期降低(Log-rank检验，P=0.007)，见图2。(2)大肠癌组织中Cortactin阴性表达、低表达、高表达患者平均生存期分别为(53.385±2.497)个月、(42.560±3.162)个月、(38.621±3.954)个月，随着Cortactin表达阳性的增高生存期降低(Log-rank检验，P=0.012)，见图3。(3)大肠癌组织中Arg(-)Cortactin(-)、Arg(-)Cortactin[(+)～(++)]、Arg[(+)～(++)]Cortactin(-)、Arg[(+)～(++)]Cortactin[(+)～(++)]患者平均生存期分别为(57.846±2.069)个月、(51.636±3.872)个月、(48.923±4.194)个月、(37.581±2.947)个月，随着Arg、Cortactin联合表达阳性的增高，生存期降低(Log-rank检验，P=0.002)，见图4。

　　5. Arg及Cortactin表达的联合分析结果(表2)：Arg及Cortactin在大肠癌组织中的表达有协同变化的趋势，表现为随着一种蛋白的表达增强，另一种蛋白也增高其表达，说明两个指标间的线性相关关系有统计学意义(r=0.303，P<0.01)。表2　大肠癌组织中Arg和Cortactin表达的关系

　　讨　　论

　　大肠癌的浸润转移是多步骤、多因素参与的复杂过程。然而，这一系列复杂步骤都离不开癌细胞自身的运动能力。癌细胞的运动包括细胞膜的伪足样伸展、膜流动性及细胞极性的变化等，是癌细胞侵袭转移各步骤基本的共同特征，必须依赖于细胞膜下的肌动蛋白的装配过程[1-3]。这个过程需要肌动蛋白相关蛋白复合体(Arp2/3)的激活[4]，Cortactin是Arp2/3重要的激活因子[5]，由CTTN基因编码，位于染色体11q13，Cortactin主要由氨基端(A)、重复区域(Repeat)、Src同源结构域3(Src-homology 3，SH3)等构成，其中A是激活Arp2/3的功能区。Cortactin通过A区域结合并激活Arp2/3，促进Arp2/3介导的肌动蛋白聚合，带来细胞的运动实现，包括迁移、内吞及侵袭活动等[6]。

　　Abl属于细胞内非受体型酪氨酸激酶，哺乳动物Abl家族包括Abl1和Arg两个成员，二者在结构和功能上极为相似[7-8]。Abl主要由SH3、Src同源结构域2(SH2)和1个激酶结构域(tyrosine kinase，TK)组成。紧接激酶区后有3个脯氨酸富集区，能够优先结合含有SH3结构域的蛋白质[9]。有实验表明Arg和Cortactin相互作用促进黏附依赖性细胞前缘膜突出，Cortactin的SH3区与Arg的3个脯氨酸富集区之一相结合，切断Arg与Cortactin SH3区的联系会减弱黏附依赖性细胞边缘突出[10]。

　　本研究采用免疫组织化学SP法对80例大肠癌组织、30例大肠腺瘤和30例癌旁正常组织中Arg和Cortactin的表达进行了检测，结果发现在结肠癌旁正常组织和大肠腺瘤中不表达，而在80例大肠癌组织中有56例(70%)和54例(67.5%)表达阳性。同时本研究结果显示，Arg和Cortactin阳性表达与大肠癌肿瘤分化程度、Dukes分期和5年生存率相关(P<0.05)，随着Arg和Cortactin表达阳性的增高，生存期降低(Log-rank检验，P<0.05)，而与患者的年龄和性别无明显联系(P>0.05)。提示Arg和Cortactin有可能成为判断大肠癌恶性程度及转移的有价值指标，同时也可能作为大肠癌预后判断的有价值的因子。另外，本研究结果显示Arg的表达与Cortactin的表达呈正相关，而且随着Arg、Cortactin联合表达阳性的增高，生存期降低(Log-rank检验，P<0.01)，说明二者有可能共同促进肿瘤的浸润、转移。通过对Arg和Cortactin表达的综合分析，说明二者联合检测更有利于结肠癌侵袭能力的分析和患者预后的判断。

　　综上所述，Arg和Cortactin与大肠癌的发生、浸润、转移、预后有关，临床上可联合检测二者，从而对大肠癌的诊断、治疗开辟一条新的途径。

　　(本文图片见光盘)

　　【参考文献】

　　[1]　Pollard TD， Blanchoin L， Mullins RD.Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells.Annu Rev Biophys Biomol Struct,2000,29：545-576.

　　[2]　周燕红，何小飞，高卉，等.JNK信号通路在大肠癌侵袭和转移中的作用及机制.世界华人消化杂志，2009,17(21)：2142-2146.

　　[3]　李占霞，张国锋.大肠癌发展与肝转移的差异蛋白质组研究进展.世界华人消化杂志，2006,14(5)：508-512.

　　[4]　Higgs HN， Pollard TD. Regulation of actin filament network formation through ARP2/3 complex：activation by a diverse array of proteins.Annu Rev Biochem,2001,70：649-676.

　　[5]　Uruno T，Liu J，Zhang P，et al.Activation of Arp2/3 complex-mediated actin polymerization by cortactin.Nat Cell Biol,2001,3(3)：259-266.

　　[6]　Bryce NS，Clark ES，Leysath JL，et al.Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.Curr Biol,2005,15(14)：1276-1285.

　　[7]　Hantschel O，Superti-Furga G.Regulation of the c-Abl and Bcr-Abl tyrosine kinases.Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(1)：33-44.

　　[8]　Woodring PJ，Hunter T，Wang JY.Regulation of F-actin-dependent processes by the Abl family of tyrosine kinases.J Cell Sci,2003,116(Pt 13)：2613-2626.

　　[9]　Kipreos ET， Wang JY. Cell cycle-regulated binding of c-Abl tyrosine kinase to DNA.Science,1992,256(5055)：382-385.

　　[10]　Lapetina S， Mader CC， Machida K，et al.Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.J Cell Biol,2009,185(3)：503-519.