STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞

　　【摘要】目的 探讨STAT3基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对结肠癌SW480细胞STAT3基因的干扰作用。方法 根据siRNA设计原则，构建靶向STAT3基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/STAT3),使用脂质体法转染人结肠癌细胞系(SW480)，通过RTPCR和 Western 印迹检测结肠癌SW480细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SW480细胞后，该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 成功构建靶向STAT3基因的shRNA表达载体，转染SW480细胞，能有效抑制细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达，为STAT3基因靶向治疗提供前期的实验依据。

　　【关键词】 结肠癌;STAT3;RNA干扰;基因表达

　　信号传导及转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是转录信号传导子与激活子家族(STAT)的重要成员，是研究干扰素(IFN)信号转导机制的过程中发现的一种转录因子，可以在外界信号的刺激下激活并直接转入细胞核内引发相应靶基因的转录。近年来研究发现，STAT3是EGF，IL6/JAK，Src 等多个酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点,具有强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展过程,在多种肿瘤中都有过度激活〔1～6〕。目前，研究表明结肠癌细胞系SW480和HCT116增殖过程中STAT3蛋白表达与活化过程增强，提示STAT3过度表达和持续活化可能与结肠癌的发生、发展有关〔7〕。因此，本实验设计和构建针对STAT3基因表达的短发夹RNA(shRNA)重组质粒，转染结肠癌SW480细胞，观察重组质粒对细胞mRNA和蛋白表达的抑制作用，以期为结肠癌的基因靶向治疗提供新的靶点和为进一步的实验研究奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人结肠癌细胞株SW480细胞购自中山肿瘤细胞库;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;RPMI1640培养液购自莱德尔公司;质粒pGPU6/GFP/Neo、大肠杆菌DH5α为上海吉玛公司产品;Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒和trizol试剂购自Invitrogen公司;各种工具酶购自Fermentas公司;STAT3单克隆抗体购自Abcam公司;PCR引物和shRNA表达载体插入片段的寡核苷酸链由上海吉玛公司合成;STAT3 shRNA表达载体测序由上海英俊生物有限公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 shRNA表达载体的设计及合成 根据NCBI提供的人类STAT3基因结构(Gene ID：6774)和shRNA的设计原则，参考相关文献选取特异性序列为干扰作用的靶点〔8〕，设计合成4个可干扰序列，并设计一条经BLAST检索与现有基因文库中所有人源基因均无同源性的非特异性序列为阴性对照序列。shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′端添加了CACC，与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补;反义链模板的5′端添加了GATC，与BamHⅠ酶切后形成的黏端互补;如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。

　　STAT31正义：5′CACCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACAT

　　GTTGTTCAGCTGCTGC3′;STAT32正义：5′CACCGAGTCAGGTTGCTGGTCAAATTCAAGAGATTTGACCAGCAACCTGACTTTT

　　TTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAAAGTCAGGTTGCTGGTCAAATCTCTTGAATTTGACCAGCAACCTGACTC3′;STAT33正义：5′CACCGCATCTGCCTAGATCGGCTATTCAAGAGATAGCCG

　　ATCTAGGCAGATGTTTTTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAACATCTGCCTAGATCGGCTATCTCTTGAATAGCCGATCTAGGCAG

　　ATGC3′;STAT34正义：5′CACCGGCGTCCATCCTGTGGTACAATTCAAGAGATTGTACCACAGGATGGACGCCTTTTTTG3′反义：5GATCCAAAAAAGGCGTCCATCCTGTGGTACAATCTCTTGA

　　ATTGTACCACAGGATGGACGCC3;阴性对照，正义：5′CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCG

　　GAGAATTTTTTG3′;反义:5′GATCCAAAAAATTCTCCGAACGT　　GTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC3′。

　　1.2.2 重组质粒的构建 将DNA oligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100 μmol/L。取相应的正义链和反义链oligo溶液，退火。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃ 5 min;85℃ 5 min;75℃ 5 min;70℃ 5 min;4℃保存。退火处理后得到浓度为10 μmol/L的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20 nmol/L，用于连接反应。pGPU6/GFP/Neo载体的线性化，取2 μg pGPU6/GFP/Neo载体，进行BbsⅠ和BamHⅠ双酶切处理，37℃酶切1 h，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50 ng/μl。进行载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，每个连接反应挑取5个菌落，PCR验证阳性克隆。为检测目的基因是否正确插入及有无基因突变的产生，阳性克隆送上海英俊生物有限公司测序。

　　1.2.3 质粒转染 SW480细胞在10%FBS的RPMI1640培养液中，37℃，5% CO2条件下培养。取对数生长期的SW480细胞以4×105个/孔接种于6孔板，待细胞丰度带到80%时，用Lipofectimane2000试剂10 μl转染重组质粒4 μg，转染6 h后更换无双抗的10%FBS的RPMI1640培养液继续培养48 h。转染细胞分为7组，①空白对照组;②转染STAT31质粒组;③转染STAT32质粒组;④转染STAT33质粒组;⑤转染STAT34质粒组;⑥转染阴性质粒组;⑦脂质体对照组。

　　1.2.4 RTPCR检测STAT3 mRNA表达 Trizol提取细胞总RNA，将抽提得Total RNA进行逆转录，制备cDNA模板。以2 μl的cDNA为模板进行PCR扩增，5 S rRNA为内参照。STAT3引物序列为：上游5′CTGCCTAGATCGGCTAGAAAACT3′，下游5′TTCTAAACAGCTCCACGATTCTC3′，扩增片段为170 bp;5S rRNA引物序列为：上游5′ACGGCCATACCACCCTGAAC3′，下游5′GGCGGTCTCCCATCCAAGTA3′，扩增片段为91 bp。荧光定量PCR反应条件：95℃ 3 min;95℃ 30 s;62℃ 40 s;第2至第3步共40个循环。PCR反应结束后取5 μl产物用3%琼脂糖凝胶(内含嗅化乙啶)电泳,紫外灯下观察并用凝胶成像系统成像，通过FTC2000A检测样本Ct值。

　　1.2.5 免疫印迹(Western印迹)检测STAT3蛋白表达 细胞转染72 h，经胰酶消化后收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入预冷至4℃的裂解缓冲液,冰上作用20 min后12 000 r/min，离心2 min后，上清液保存于-20℃。采用Bradford 法测定蛋白质浓度，以50 μg/孔上样，12%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白质从SDSPAGE 凝胶转移至硝酸纤维素膜。后者在含5%脱脂奶粉的TTBS 中37℃封闭90 min，加入一抗4℃孵育过夜;TTBS充分漂洗(10 min×3次)，加入二抗37℃作用40 min，TTBS充分漂洗(10 min×3次);化学荧光法(ECL)显色,以βactin蛋白为内参照，放入KODAK Image Station 2000MM Digital Imaging System，曝光获取图像。分别分析灰度值，比较各组蛋白表达量。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS13.0 统计软件进行数据分析。计量资料以x±s表示,原始资料应用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒的PCR鉴定 挑选单克隆菌株，接种到含50 μg/ml 卡那霉素的LB培养集中，振荡过夜，使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamHⅠ，PstⅠ分别酶切鉴定。阳性重组载体可以被BamHⅠ切开，而不能被PstⅠ切开。见图1。

　　M：lamda/Eco130I;最左上侧1～5为STAT31(1～5)Pst I酶切结果，6～10为STAT32(1～5)Pst I酶切结果;其右侧1～5为STAT31(1～5)BamH I酶切结果，6～10为STAT32(1～5)BamH I酶切结果;最左下侧1～5为STAT33(1～5)Pst I酶切结果，6～10为STAT34(1～5 Pst I酶切结果;其右侧1～5为STAT33(1～5)BamH I酶切结果，6～10为STAT34(1～5)BamH I酶切结果

　　图1 重组载体的酶切鉴定图

　　2.3 荧光定量RTPCR结果 通过荧光定量PCR检测STAT3基因mRNA表达，以5S rRNA为内参照，扩增片段大小与所设计的目的基因大小一致，STAT3和5S rRNA设计扩增片段分别为170 bp和91 bp，通过FTC2000A检测各样本Ct值比较各组STAT3 mRNA的表达情况。4个pGPU6/GFP/STAT3重组质粒组(2、3、4、5组)转染SW480细胞的STAT3 mRNA表达较对照组显著下降(P<0.05)，4个pGPU6/GFP/STAT3重组质粒组对STAT3基因的抑制率分别为55%、69%、60%和54%。见图3。

　　2.2 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒的测序鉴定 对PCR鉴定的4个阳性克隆分别进行测序，经过比对，4个干扰质粒中均含有目的基因序列，证实了4个重组质粒构建成功。见图2。

　　图2 STAT31、STAT32、STAT33和STAT34测序图M：50 bp DNA Marker;1：空白对照组;2：转染STAT31质粒组;3：转染STAT32质粒组;4：转染STAT33质粒组;5：转染STAT34质粒组;6：转染阴性质粒组;7：脂质体对照组。AG为各组的内参5S rRNA

　　图3 RTPCR检测各组SW40细胞STAT3 mRNA的表达

　　2.4 Western印迹检测各组细胞STAT3的蛋白表达 见图4。分析结果表明，各组的内参照βactin表达的显影是一致的，而在STAT3蛋白表达各组各有不同，4个pGPU6/GFP/STAT3重组质粒组(2、3、4、5组)STAT3蛋白表达明显低于空白对照组、

　　1：空白对照组;2：转染STAT31质粒组;3：转染STAT32质粒组;4：转染STAT33质粒组;5：转染STAT34质粒组;6：转染阴性质粒组;7：脂质体对照组。

　　图4 各组STAT3蛋白的表达阴性质粒组和脂质体组，光密度值分析结果显示4组STAT3 shRNA重组质粒均高于空白对照组。对照组为0.836±0.034，4个重组质粒组分别为0.526±0.023、0.5±0.026、0.516±0.031和0.52±0.027。与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，4个重组质粒组比较无明显差异。

　　3 讨 论

　　自从上世纪90 年代STAT家族被发现以来，许多研究表明JAKSTAT信号传导途径的异常与多种疾病关系密切，例如自身免疫性疾病(过敏性腹泻、类风湿关节炎)，感染性疾病(脓毒症)，肿瘤(白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤)等〔9〕。STAT3是STAT的重要成员,其信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，STAT3激活是多种原癌基因诱导细胞癌变所必需,即STAT3通过持续酪氨酸磷酸化(持续性活化)及过度表达对抗细胞的正常凋亡机制,使细胞过度生长及凋亡障碍,进而癌变;同时这一作用能够对肿瘤的分化和进展起明显抑制作用,目前将其定义为癌基因〔10〕。但是，实验研究表明在正常鼠成纤维细胞及人口腔角化细胞、乳腺细胞中阻断STAT3 信号通道并不影响细胞生长〔11〕。因此，本实验选取STAT3基因作为肿瘤治疗的靶点，既可以抑制癌基因的表达，又不会过多地损伤正常细胞的功能。

　　在选中肿瘤治疗靶点后，还要寻找能够有效抑制癌基因表达的方法。RNA干扰(RNAi)是一种有效的基因沉默技术，在基因功能研究、抗病毒、抗肿瘤、药物靶点筛选和细胞信号传导通路分析中显示了其良好的效果。有文献报道，通过shRNA使目的基因失活是RNAi的有效途径〔12，13〕。

　　本实验针对STAT3基因设计4条具有干扰效果的DNA片段，经过退火处理后得到shRNA模板，将RNA干扰序列克隆至pGPU6/GFP/Neo载体中，经酶切和DNA测序鉴定完全正确，说明成功成功构建了表达STAT3 shRNA的真核表达载体。采用脂质体法转染人结肠癌SW480细胞株，通过RTPCR和Western印迹检测转染后细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达情况，结果表明pGPU6/GFP/STAT31、2、3、4转染组细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达均较空白对照组、阴性质粒转染组和脂质体组明显减少，而空白对照组、阴性质粒转染组和脂质体组比较无明显差异，说明pGPU6/GFP/STAT3质粒能够成功的沉默结肠癌SW480细胞的STAT3基因，结果抑制肿瘤细胞的STAT3 mRNA和蛋白的表达，从而为下一步以STAT3为靶基因进行肿瘤基因治疗的实验研究奠定了实验基础，并且STAT3也有望成为结肠癌基因治疗的新靶点。

　　【参考文献】

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