NF-κBp65在肝癌血管生成中的作用

　　作者：金东华,叶学忠　　作者单位：238000 巢湖市第二人民医院普外一科

　　【摘要】目的 本实验通过对肝细胞癌(HCC)组织、癌旁组织、肝硬化组织及正常肝组织中NF-κBp65蛋白表达和微血管密度(MVD)进行检测，探讨NF-κBp65的蛋白表达与HCC新生血管生成的关系，初步阐述NF-κBp65在HCC血管生成中的机制。方法 选用45例肝细胞癌组织和32例癌旁肝组织、15例肝硬化组织、10例正常肝组织标本作对照，采用免疫组化法(SABC)检测NF-κBp65的表达和MVD值，并结合患者的临床病理指标进行统计学分析。结果 NF-κBp65在HCC中的表达及MVD值显著高于癌旁肝组织、肝硬化组织和正常肝组织(P<0.05);HCC组织中NF-κBp65阳性表达组显著高于阴性表达组(P<0.05);血管侵犯组显著高于无血管侵犯组(P<0.05)。结论 NF-κBp65在HCC组织中的表达高于癌旁肝组织、肝硬化组织和正常肝组织;HCC中NF-κBp65的表达与肝癌血管生成有关。

　　【关键词】 肝细胞癌;核转录因子-KB;微血管密度;免疫组化

　　The effect of the expression of NF-ΚBp65 with the angiogenesis of hepatocellular carcinoma　　Jin Donghua, Ye Xuezhong　　Department of General Surgery, the Second People's Hospital of Chaohu, Chaohu 238000

　　[Abstract] Objective By testing the expression of NF-κBp65and by counting micro vascular density(MVD) in HCC tissues, Para tumor tissues, cirrhosis liver tissues and normal liver tissues, to determine the relationship between the former three factors and angiogenesis in HCC tissues, furthermore to document the mechanism of NF-κBp65 in angiogenesis of HCC. Methods Forty-five tumor tissue samples and thirty-two tumor-surrounding tissues samples were obtained from primary HCC patients undergoing surgical resection. Fifteen cirrhosis liver tissues and ten normal liver tissues samples were taken from previously patients with a benign tumor. SABC method of Immunohistochemistry was used to determine the relationship between their expression and clinicopathological parameters.Results Statistical analysis revealed that NF-κBp65-positive stain rate was higher in tumor tissues than that in tumor-surrounding tissues, cirrhosis liver tissues and normal liver tissues. (P<0.05). Numerical value of MVD was significantly higher in tumor tissues than that in tumor-surrounding tissue, cirrhosis liver tissue and normal liver tissue (P<0.05). Numerical value of MVD was higher in tumor tissue samples with NF-κBp65 positive stain than that in their negative tumor tissue samples. (P<0.05). The expression of NF-κBp65 in vascular invasion of tumor tissue samples was higher than that in vascular non invasion of tumor tissue samples. (P<0.05) .Conclusion NF-κBp65 positive stain rate were higher in the tumor tissue than that in tumor-surrounding tissue, in cirrhosis liver tissue and in normal liver tissue. The over expression of NF-κBp65 in the hepatocellular carcinoma were associated with tumor angiogenesis of HCC.

　　[Key words] Hepatocellular carcinoma; Nuclear factor-kappaB; Microvascular density; Immunohistochemistry

　　HCC是一种典型的高血供的实体肿瘤，肝癌组织中丰富而扭曲的血管是HCC的组织学特点。临床上可观察到肿瘤组织中血管密度高的病人其预后较差，同时发现肿瘤血管生成是HCC血管侵犯和转移的标志。肿瘤血管生成在HCC的生长过程中起着十分重要的作用[1，2]。新生的结构存在缺陷的肿瘤血管为肝癌细胞提供营养物质和其他必要的细胞因子，不仅为肝癌肝内转移提供了便利的途径，而且为其肝外转移打开了门户。HCC血管生成的调控是非常复杂的，我们选择了核转录因子-KB，它似乎是在这一网络中处于相对中心的位置。本研究设计用免疫组化技术检测NF-κBp65在HCC组织、癌旁肝组织、肝硬化组织和正常肝组织中表达及MVD值，探讨：①NF-κBp65在HCC组织、癌旁肝组织、肝硬化组织和正常肝组织中表达情况和HCC临床病理关系;②阐述NF-κBp65在HCC血管生成中的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 收集我院和弋矶山医院1999年1月～2005年9月手术切除的肝细胞性肝癌石蜡包埋标本45例(其中有癌旁组织32例)，其中男性39例，女性6例;年龄36～69岁之间，平均年龄52.53±7.97岁。32例癌旁组织标本取自距肝癌组织边缘2 cm以上的肝组织，病理证实无肿瘤细胞浸润。肝硬化组织标本15例，正常肝组织10例(其中肝外伤切除的正常肝组织3例，肝血管瘤患者瘤旁正常肝组织7例)。全部标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片贴于APES防脱片胶处理过的载玻片上备染。每例连续切片3张，1张做病理诊断，1张做微血管密度(MVD)染色，1张切片行NF-κBp65免疫组化染色。

　　1.2 方法 免疫组化试剂盒(鼠抗人NF-κBp65单克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用SABC免疫组化化学染色。

　　1.3 结果判断标准 NF-κBp65免疫反应阳性物质主要位于细胞浆或胞核，呈棕黄色至棕褐色颗粒为阳性细胞。NF-κBp65采用半定量积分法，每例标本积分=切片中显色细胞比例记分×切片中显色强度记分，0分阴性(-);1～4分弱阳性(+);5～8分阳性(++);9～12分强阳性(+++)。MVD值的测定按Weinder[3]报道方法进行，先在低倍光镜(×40)下选取3个微血管密度最高的视野即热点区(host spot)，再于高倍镜视野下计数微血管的数目，求得3个视野的均值作为MVD值，以±s表示。

　　1.4 统计学处理 所有结果均经统计软件SPSS14.0进行统计学分析，NF-ΚBp65的表达情况以及与HCC临床病理因素之间的关系采用χ2检验;MVD值与HCC临床病理因素之间的关系采用方差分析和t检验;NF-κBp65与MVD关系的分析采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 NF-κBp65在HCC癌细胞胞浆或胞核中表达 阳性表达为棕黄色网状或细颗粒状，可见核深染，主要以弥漫性表达为主，染色均一，与细胞所处癌体团块位置关系不大;癌旁组织和肝硬化组织标本中亦有阳性表达，但仅为少数，且呈弱阳性，而正常肝组织无阳性表达(图1见221页)。

　　2.2 NF-κBp65在正常肝组织、肝硬化组织、癌旁组织和HCC中的表达 NF-κBp65在HCC组织中的阳性表达率为73.3%(33/45)，其中6例呈弱阳性(+)、10例阳性(++)、17例强阳性(+++);32例癌旁组织NF-κBp65的阳性表达率为21.8%(9/32);15例肝硬化组织中NF-κBp65的阳性表达率为20%(3/15)而10例正常肝组织中无NF-κBp65阳性表达(图2-4见221页)。HCC组织和非癌组织之间NF-κBp65的表达比较差异明显，有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 NF-κBp65的表达与HCC临床病理参数的关系 HCC组织中，NF-κBp65的表达与患者的年龄、性别、肿瘤数目及肿瘤直径均无相关性(P>0.05 )，而与肝癌TNM分期、组织学分级和有无血管侵犯密切相关，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。表1 NF-κBp65的表达与HCC临床病理参数的关系病理临床特征例数NF-κBp6560.716.03<0.052.4 NF-κBp65的表达与MVD值的关系 HCC组织中，NF-κBp65表达阳性组MVD值为100.73±24.01，表达阴性组MVD值为74.54±16.47，两组间比较，阳性表达组明显高于阴性表达组，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。表2 HCC组织中NF-κBp65的表达与MVD值的关系

　　3 讨论

　　原发性肝癌(primary liver cancer, PLC)是常见的恶性肿瘤之一，90%以上是肝细胞癌(HCC)[1]。我国是原发性肿瘤的高发国家，发病率、死亡率均居世界之首，每年约11万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡数的45%[4]。肝癌的高血供和经血液途径扩散的特性提示血管生成可能在肝癌的发展、转移、预后等生物学行为中发挥重要的作用。

　　核转录因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB) 是 1986年Sen和Baltimore[5]首先从B淋巴细胞核抽提物中检出，可与免疫球蛋白的轻链基因增强子κB序列(GGGACTTTCC)特异性结合的核蛋白因子。Rel/P50(P65/P50)异源二聚体，是其最重要的存在形式，也称NF-κB。P50通过核定位信号直接与DNA结合;P65含转录活化区域，具有转录激活功能，参与基因转录的起始调节。NF-κB广泛存在于各种细胞中，并参与多种基因的转录调控[6]。

　　实验结果表明NF-κBp65的表达在正常肝组织、肝硬化组织和癌旁肝组织、HCC组织中呈逐级递增趋势，说明NF-κBp65的活化与HCC形成密切相关。推测NF-κBp65活化后进入核内上调癌基因表达，抑制肿瘤细胞调亡，促进肿瘤发生。对照肝硬化组出现NF-κBp65的微弱表达，但无一例核上表达，可以反映NF-κBp65处于不断激活和失活的有序调控中，是细胞调节正常生理功能，维持生死平衡所必需。本研究也发现，部分癌旁组织尽管细胞形态学上未表现出异常，但应用免疫组化检测NF-κBp65时，则有部分组织显示了异常反应，32例癌旁组织中NF-κBp65 的阳性表达率为21.8%(9/32)与正常肝组织(0%)相比，其表达率具有显著意义。说明肝癌的转移是一个早期即发生的行为，在应用常规病理学检查难以发现异常时，实际上分子生物学水平上已发生了改变。

　　表1结果表明血管侵犯与NF-κBp65的高表达密切相关;在HCC患者NF-κBp65的表达和HCC组织分化密切相关;随着肿瘤恶性程度增高，NF-κBp65的表达也相应增高，TNM分期越晚，NF-κBp65的表达越高。上述结果说明，NF-κBp65可能参与了HCC的发展，并扮演了极其重要的角色。本实验中也发现在HCC组织MVD与NF-κBp65的表达呈正相关(如表2)，HCC组织NF-κBp65的阳性表达反映了肝癌细胞增殖活跃，大量的肿瘤细胞增生能挤压肿瘤间质，使之张力增加，间质内微血管受挤、扭曲或阻塞，使局部缺氧，而低氧能启动或上调肿瘤细胞分泌某些血管因子的表达，如VEGF等[7]能促进内皮细胞增生，微血管扩张和延伸，微血管密度增高，从而满足肿瘤细胞对养料和氧气的需要，有利于肿瘤的增生和扩张，而增生的内皮细胞有能分泌大量的生长因子，直接促进肿瘤细胞增殖，这可能是MVD与NF-κBp65具有相关性的解释。这也说明，NF-κBp65阳性表达在HCC血管形成过程中起着重要的作用。

　　大多数研究发现，NF-κBp65参与了血管形成的过程[8-10]。NF-κBp65作用于血管生成的诸多环节：①肿瘤细胞能产生与释放多种血管生成因子，促进肿瘤血管生成。在已发现的血管生成因子中，已证明TGF-β、IL-1、IL-8含有特异性NF-κBp65 的结合位点，其表达受NF-κBp65调控[11];②粘附分子在内皮细胞形成管状结构中，从一维的基因调节向三维的血管结构转化发挥着至关重要的作用[12]，而内皮细胞的粘附主要是有细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)介导的。己知ICAM-1结构中含有NF-κB结合序列，是NF-κB调节的靶基因[13]。③血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)是血管内皮细胞的特异性配体，是维持血管稳定性和管腔形成的关键因子。Ang-1促进内皮细胞中NF-κBp65并通过TRAF2介导的抗凋亡途径激活NF-κBp65的抗调亡活性，抑制内皮细胞凋亡，稳定血管结构[14]。④NF-κBp65上调整合素的表达，肿瘤血管内皮细胞特异性表达整合素ανβ3和ανβ5，Wu等[15]研究表明ανβ5是NF-κBp65调节的靶基因，调节内皮细胞之间以及内皮细胞与基质之间的粘附。

　　上述表明，NF-κBp65的表达可能对HCC血管形成具有核心的调节作用。推测NF-κBp65促进HCC血管生成的机制可能是：通过某种机制使NF-κBp65在肝癌组织中过高表达，抑制或促进血管生成的调节基因或作用的中介位点，从而过度抑制血管内皮细胞的凋亡并促进其增殖，导致HCC血管生成增加，同时NF-κBp65抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤过度增殖，而肿瘤细胞可释放肿瘤血管生成因子(tumor angionesis factor,TAF)及多种血管生成因子，诱导HCC血管生成。

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