HIF-1α与COX-2在胃癌中的表达及相关性

　　作者：孟立俊,周理好,陶,磊,孙景洲　　作者单位：237008 六安市第二人民医院外科

　　【摘要】目的 探讨缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 和环氧合酶-2 (COX-2) 在胃癌组织中的表达及其相关性。 方法 对66例手术切除的胃癌标本和15例正常胃黏膜组织进行连续切片， 用免疫组织化学方法检测 HIF-1α 和COX-2 蛋白的表达情况。 结果 胃癌组织中HIF-1α蛋白表达阳性率为 68.2% ，COX-2 蛋白阳性表达率为 62.1% ，均较正常胃黏膜组织显著增高;COX-2 阳性表达与HIF-1α表达呈正相关(r=0.405， P=0.001 )。HIF-1α蛋白的表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关 ( P<0.05) ;COX-2 蛋白的表达与胃癌的淋巴结转移及TNM分期密切相关 ( P<0.05)。 结论 胃癌组织中 COX-2 和 HIF-1α 的表达增加与胃癌的不良生物学行为相关，可能成为预测胃癌侵袭转移的重要指标。

　　【关键词】 胃癌;缺氧诱导因子1α ;环氧合酶-2;免疫组化

　　Expressions and significance of cyclooxygenase-2 and hypoxia inducible factor-1α in gastric carcinoma　　Meng Lijun ,Zhou Lihao ,Tao Lei, et al　　Department of General Surgery, the Second People's Hospital of Lu'an ，Anhui Province 237008　　[Abstract] Objective To investigate the expression and relationship of HIF -1a protein and COX-2 protein in gastric carcinoma. Methods The immunohistochemical expression of HIF-1α and COX-2 were detected for 66 specimens of gastric carcinoma and 15 cases normal gastric mucosa and the correlation of these expression with clinic opathologic features were examined. Results The protein positive expression rate of HIF-1alpha and COX-2 in tumor samples were significantly higher than those in normal tissues (P < 0.01). The positive expression rate of HIF-1alpha and COX-2 were 68.2% and 62.1% respectively. Expression of HIF-1α protein in gastric carcinoma were associated with their depth of invasion(P=0.044)，lymphatic node metastasis(P=0.018) and TNM stage(P=0.024), but not with age, gender, tumor size , degree of tumor differentiation(P>0.05). The expression of COX-2 protein were associated with their lymphatic node metastasis(P=0.018) and TNM stage(P=0.042), not with age, gender, tumor size , depth of tumor invasion and degree of tumor differentiation(P>0.05). A positive correlation was found between the expression of HIF-1αand COX-2 protein in gastric carcinoma.( r=0.405, P=0.001 ). Conclusions The overexpressed of HIF-1α and COX-2 protein are related with poor biological behavior of gastric carcinoma. They can be taken as useful predicators for predicting invasion, metastasis of gastric carcinoma.

　　[Key words] Gastric carcinoma; Hypoxia inducible-1α; Coclooxygenase-2; Immunohistochemistry

　　缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 和环氧合酶-2 (COX-2)已成为肿瘤研究中的一个热点，但关于胃癌中COX-2与HIF-1α的表达与其生物学行为关系的研究目前争议仍较多，COX-2与HIF-1α在胃癌中的表达的相关性研究也尚无定论。基于上述因素，设计进行本实验，用免疫组化方法，研究COX-2和HIF-1α在胃癌中表达的规律及其相关性，为临床判断胃癌的生物学特性，估计复发和转移，制定合理的个体化综合治疗方案，提供实验依据。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 收集安徽省六安卫生学校附属医院2003～2007年期间手术切除胃癌标本中资料完整的66例， 另取其中15例距肿瘤边缘大于5 cm处的正常胃黏膜组织作为对照， 标本经40 g/L福尔马林固定， 常规石蜡包埋， 制成4 μm厚的切片，HE染色供定位用。81例中男性58例，女性23例;平均年龄57.3 (32～74) 岁。胃癌组66例按分化程度分为中高分化组(中分化、高分化管状腺癌及乳头状腺癌)和低分化组(低分化腺癌、未分化癌、黏液腺癌和印戒细胞癌)，所有患者术前均未接受放、化疗。

　　1.2 方法 采用免疫组化S-P法，兔抗人HIF-1α抗体(BAO912)和一抗购自武汉博士德公司，COX-2鼠抗人单克隆抗体(克隆系COX229)，即用型试剂盒和一抗均购自北京中山生物技术有限公司。实际操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，用PBS代替一抗做阴性对照。

　　1.3 免疫组化结果判断 参照Fujita等[1]HIF-1α分级标准，以细胞胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，根据阳性意义(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小及分化程度等无关(P > 0.05)。见表1。

　　细胞数所占比例选择1 000个细胞计数进行结果判断，≤10%为阴性(-)，11%~50%为弱阳性(+)，51%~80%为中度阳性(++)，>80%为强阳性(+++)。COX-2表达 [2]以细胞质中出现棕黄色颗粒为显色阳性。阳性细胞数计数>10%为阳性，≤10%为阴性。

　　1.4 统计学处理 所有数据统计均由SPSS14.0软件包完成，率的统计分析采用Pearson Chi-square或Fisher's Exact Test检验;相关性分析采用Spearman等级相关分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 HIF-1α表达与胃癌临床病理参数的关系 HIF-1α主要在癌细胞胞质中有阳性染色(彩图1，见封2)，阳性部位着棕黄色，肿瘤坏死明显区域和肿瘤浸润的边缘，阳性染色明显增多，66例中45例阳性(68.2%);正常胃黏膜组织未见阳性染色，正常胃黏膜组与胃癌组相比差异显著。HIF-1α蛋白阳性表达在胃癌浸润深度、淋巴结转移和PTNM分期方面差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　2.2 不同组织标本中COX-2表达与胃癌临床病理参数的关系 COX-2蛋白的阳性表达部位主要在癌细胞胞质中呈棕黄色颗粒，间质中亦可见散在表达(彩图2，见封2)。

　　66例胃癌组织标本中COX-2阳性为41例(62.1%)。正常胃黏膜组织3例阳性染色(4.5%)，正常胃黏膜组与胃癌组相比差异有统计学意义(P=0.000)。COX-2阳性表达在淋巴结转移和PTNM分期方面差异显著(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、胃癌浸润深度及分化程度等无关(P > 0.05)。见表2。

　　2.3 胃癌组织中HIF-1α表达与COX-2阳性表达的关系 45例HIF-1α阳性标本中有34例同时存在COX-2表达;而在25例COX-2阴性标本中有14例伴HIF-1α表达缺失。相关分析表明，胃癌中HIF-1α的表达和COX-2的表达呈正相关(r=0.405， P=0.001 )。见表3。

　　3 讨论

　　如何准确评估胃癌的生物学行为，一直困扰着外科临床。传统的TNM分期难以满足临床需要，随着分子生物学和分子免疫学的研究进展，人们正设法寻找更有效的预测指标。本研究显示，联合检测胃癌组织中HIF-1α和COX-2具有较重要的价值。

　　缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一。恶性肿瘤生长过快必然造成局部组织严重缺氧和供能与耗能之间的不平衡。缺氧诱导的相关转录因子包括缺氧诱导因子-1，-2和NF-кB，其中缺氧诱导因子-1(HIF-1)的作用最为重要。HIF-1是1992年由Semsenza发现的一种DNA结合蛋白，是迄今为止发现的第一个调节细胞内氧稳态平衡的调节因子，是介导细胞对缺氧微环境进行适应性反应关键性转录调控因子，由HIF-1α和HIF-1β组成。HIF-1α被认为是唯一的氧调节亚单位，其活性在维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成以及促进肿瘤增殖和转移中起重要作用[3，4]。研究认为，HIF-la在肝癌、乳腺癌、结肠癌、早期宫颈癌等多种肿瘤组织中过度表达并调节其生物学行为 。

　　本研究结果显示，HIF-1α在胃癌组织中的阳性表达率为68.2%，其主要表达于肿瘤细胞的胞核及胞质内，而在间质中则表达极弱，正常胃组织中无表达。这与目前多数结论一致。但HIF-1α在胃癌组织中的阳性表达与胃癌生物学行为之间的关系，目前争议较大。Ma等研究发现[5]，HIF-1α在胃癌组织中的阳性表达主要与肿瘤TNM分期、淋巴结转移和远处转移相关，而与肿瘤大小、组织分化程度和肿瘤浸润深度关系不大;熊春波[6]等人则认为胃癌中HIF-1α的表达与肿瘤分化、浸润深度、淋巴结转移均有关，而与TNM分期无关。我们的研究显示HIF-1α的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移和TNM分期显著相关。这与孙威[7]等研究结论一致。随着肿瘤浸润深度的增加(T1-T2→T3-T4)，淋巴结转移的发生和PTNM分期的越晚(Ⅰ、Ⅱ期→Ⅲ、Ⅵ期)， HIF-1α的阳性率逐渐增高，可能随着癌的演进，局部微环境缺氧加重，HIF-1α表达增加，而HIF-1α表达增加不仅可以促进肿瘤新生血管的生成，而且为肿瘤细胞带来更多的氧和营养物质，为肿瘤的侵袭和远处转移带来便利条件[8]。由此可见，HIF-1α的表达与胃癌的演进、恶性程度高低及侵袭能力有一定的关系。

　　环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成过程中的一个重要的限速酶，哺乳动物的环氧化酶至少有两种形式，COX-1为结构型基因，在正常组织和细胞内表达，参与维持其正常生理功能。环氧合酶-2(COX-2)为诱导型基因，在人类多数肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。近年来众多研究表明， COX-2参与了癌症的发生和进展[9] ， 近10年来大量研究表明，COX-2的过度表达与消化系肿瘤的发生、发展密切相关，但作用机制尚不清楚。我们的研究证实胃癌中COX-2蛋白的阳性表达率远大于正常胃组织(62.1% vs 4.5%，P = 0.000)，阳性部位主要在胃癌细胞胞质中，间质中亦可见散在表达。我们研究发现，胃癌中COX-2表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度和肿瘤浸润深度等因素无关，COX-2在伴有淋巴结转移或PTNM分期较晚的癌组织中的表达率要明显高于不伴淋巴结转移或PTNM分期较早者，由此可见，胃癌组织中COX-2过度表达与胃癌淋巴结转移和PTNM分期较晚等不良生物学行为有关，这与Samaka等报道相一致[10]。但COX-2的表达与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移等临床病理因素的关系，目前意见也尚存分歧。Yamac等[11]研究认为，COX-2的表达与肿瘤大小、PTNM分期和淋巴结转移负相关，并且COX-2的表达只在胃癌早期而不在胃癌进展期中起重要作用。国内吕晓君等[12]研究显示， COX-2表达与胃癌胃壁浸润深度呈正相关， 其过度表达与胃癌的侵袭转移能力密切相关。研究结果的差异可能与研究方法的不同、取材的差异、阳性判定标准的差异及胃癌本身生物学行为不同等因素有关，有待于进一步的多中心、大样本病例的研究给予定论。

　　肿瘤组织中HIF-1α和COX-2的表达有无相关性?国内姜超等在研究肝癌时利用不同浓度的选择性COX-2抑制剂美洛昔康对在正常和氯化钴模拟缺氧条件下培养的肝癌SMMC-7721细胞进行处理，发现常氧条件下HIF-1α表达相对值为0.185±0.057，经美洛昔康处理后HIF-1α不表达，缺氧刺激下HIF-1α表达相对值升高至1.011±0.131，而加入美洛昔康后明显降低(P<0.05)，且随着美洛昔康浓度的增加，降低越明显(P<0.05)。结论肝癌组织中HIF-1α和COX-2的表达密切相关，选择性COX-2抑制剂的抑癌作用机制可能部分是由HIF-1α介导的[13]。尹时华[14]研究喉癌肿瘤组织HIF-1α与COX-2蛋白和mRNA的表达关系时发现HIF-1α与COX-2在喉鳞状细胞癌组织的表达增高并密切相关，并认为可能是喉癌发生发展的原因之一。胃癌中两者相关性的研究所见文献并不多。Huang[15]等用COX-2抑制剂NS-398预处理胃癌AGS细胞株可有效地抑制癌组织中HIF-1α的积聚，因而认为COX-2增加胃癌中HIF-1α的表达，两者相关性较强。本组实验证实，胃癌中HIF-1α与COX-2的表达呈正相关(r=0.405，P=0.001 )，提示在胃癌

　　中HIF-1α与COX-2的作用密切相关，两者可能协同参与了胃癌的发病进程，并在胃癌的侵袭、转移过程中可能起着重要的协同效应。这有助于加深对胃癌发生机制的认识。因此，可以考虑用反义DNA技术或COX-2抑制剂干扰COX-2的表达或抑制其活性，进而抑制HIF-1α的表达，最终抑制恶性肿瘤的发生或促进其凋亡和坏死。

　　【参考文献】

　　[1] Fujita Y,Nishigaki Y,Aoki M,et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha is associated with unfavorable prognosis in non-small cell lung cancer. Clin Oncol,2004,22(14S):653.

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　　[12] 吕晓君, 毛晓韵, 李锦毅, 等. 利用组织芯片技术研究COX-2在胃癌中的表达及其与血管生成的关系. 世界华人消化杂志, 2006, 14: 550-556.

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