P16Ink4a、P14ARF在大肠癌中抑癌地位的初步研究

　　作者：吕光军,成志刚,杨,光　　作者单位：200002 上海市黄浦区中心医院外科

　　【摘要】目的 研究P16Ink4a、P14ARF在大肠癌中的表达，了解P16Ink4a、P14ARF在大肠癌进展中的作用。方法 采用免疫组织化学方法检测30例大肠癌患者中P16Ink4a、P14ARF的表达情况。结果 P16Ink4a表达阳性而P14ARF阴性的有3例，而P16Ink4a阴性、P14ARF阳性的有14例。结论 P16Ink4a、P14ARF在大肠癌发生发展中发挥着不同的作用，存在某种互补性。

　　【关键词】 大肠癌;P16Ink4a;P14ARF

　　P16Ink4a、P14ARF damp the cancer status in the colon cancer the preliminary study　　Lu Guangjun, Cheng Zhigang, Yang Guang　　Department of surgery, Central Hospital of Huangpu District Shanghai 200002, China

　　【Abstract】 Objective To study the expression of P16Ink4a、P14ARF in colorectal carcinoma for the purpose of understanding the role of P16Ink4a、P14ARFin the progression of tumors. Methods Expression of P16Ink4a、P14ARF was examined by immunohistochemical method, all data tested by x 2 test. Results In 30 case of colorectal carcinoma, negative expression of P16Ink4a but positive expression of P14ARF protein were detected in 14 cases, and the expression of P16Ink4a but negative expression of P14ARF were detected in 3 cases. Conclusion P16Ink4a and P14ARF play different role in the progression of colorectal cancer.Expression and significance of P16Ink4a、P14ARF in colorectal cancer.

　　【Key words】 Colorectal cancer; P16Ink4a;P14ARF

　　目前普遍认为P16Ink4a与大肠癌的生物学行为相关[1]，但最近研究认为，INK4a基因可利用不同的读码框，编码另一个与P16Ink4a功能完全不同的蛋白，即P14ARF蛋白。INK4a失活的最常见原因是突变，其中仅50%的突变影响P16Ink4a，另有50%发生于外显子2，故可能同时影响P16Ink4a、P14ARF[2]。由于这一机制的发现，使得P16Ink4a、P14ARF在大肠癌发生发展中何者是真正的抑癌基因变得模糊起来。本文采用免疫组化的方法检测30例大肠癌中P16Ink4a、P14ARF的表达情况，以期对两者在大肠癌中抑癌基因地位作一初步探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 临床资料 本组30例大肠癌病例取至2006年1月至2007年12月黄浦区中心医院手术切除病例，术后均经病理证实。男19例，女 11例;年龄 46～74岁，中位年龄62岁;肿瘤部位：结肠25例，直肠5例。临床分期按国际抗癌联盟TNM。

　　1.2 主要试剂 P16Ink4a、P14ARF单克隆抗体皆为美国 Santa CruzBiotechnology 公司产品。ABC试剂盒购自上海华美公司。

　　1.3 免疫组织化学方法 采用亲和素—生物素复合物-过阳化物酶连接法(avidin biotin-pcroxidasc complcx, ABC)免疫组化法染色。每次实验均以PBS代替一抗作为阴性对照。主要步骤如下：①常规脱腊，PBS冲洗，5min×3次。②切片浸入0.3%过氧化氢甲醇中30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，5min×3次。③玻片置入 0.01mmol/L，PH6.0的枸橼酸盐缓冲液中加热30分钟，以充分暴露抗原。④10%正常羊血清15min。⑤ 滴加一抗在湿盒中室温2小时，PBS冲洗，5min×3次。⑥滴加二抗，室温下反应60分钟，PBS冲洗，5min×3次。⑦ABC试剂反应30分钟，光镜下控制DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。

　　1.4 判断标准 参照Yasul提出的阳性判断标准：P21WAF1蛋白定位于细胞核，阳性细胞呈棕黄色至褐色，以切片中阳性细胞率≥5%为阳性病例，<5%为阴性病例。

　　1.5 统计学处理 P16Ink4a、P14ARF在大肠癌中表达的关系采用Spearman相关回归分析。以P<0.05为具有统计学意义。所有统计学处理均由SPSS10.0分析系统完成。

　　2 结果

　　2.1 大肠癌组织中P16Ink4a、P14ARF表达情况 本组30例中，5例表达P16Ink4a蛋白，阳性率为 16.7%;16例表达P14ARF蛋白，阳性率为53.3%见图1、图2。

　　2.2 P16Ink4a、P14ARF在大肠癌组织中表达的相关性见表1 P16Ink4a、P14ARF在大肠癌中的表达经spearman相关统计分析，P>0.05，无明显相关性。表1 P16Ink4a、P14ARF在大肠癌中表达的相关性

　　3 讨论

　　INK4a基因的异常是大肠癌特征性的改变，文献报道80%～95%的大肠癌有该基因的异常。近年来对该基因的研究有较大进展，我们采用免疫组化的方法检测30例大肠癌病例，对该基因在大肠癌中新认识作一初步探讨。

　　既往的研究往往注重于P16Ink4a与大肠癌的关系，但最近研究发现，INK4a基因可利用不同的第一个外显子(1α、1β)和下游的两个共同的外显子，编码二种完全不同的蛋白。外显子1α编码P16Ink4a，而外显子1β编码P14ARF。外显子1β距外显子1α5′端方向约13～20kb处。尽管1α和1β的长度相同，而且1β的外显子2正是1α的剪接子，但由于1β改变了外显子2的阅读框架，因而两者无相同的氨基酸序列，因而是两种完全不同的蛋白[3]。两种蛋白的调控途径也是完全不同的：16Ink4a的调控机理：作为一种细胞周期素依赖蛋白激素酶抑制蛋白(CKI)，P16Ink4a通过与CyclinD竞争结合CDK4/6来抑制CDK4/6的活性，从而导致RB蛋白非磷酸化，非磷酸化的RB与E2F的启动子结合，通过阻断E2F的反式激活域或引进组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制E2F的转录[4]。P14ARF的调控机理：MDM2可通过抑制p53 N-端的转录活性域来阻断p53的转录[5]，而P14ARF外显子1β编码的N端与MDM2的C端相结合后，可以促进MDM2的降解[6]。因而，通过MDM2的不同区域，可形成稳定的P14ARF-MDM2-p53三元复合物，P14ARF可恢复被MDM2抑制的p53的转录。

　　这一机制的重要性在于：细胞增殖失控和细胞凋亡障碍是癌变的根本原因。肿瘤细胞或者通过干扰RB蛋白功能使细胞周期紊乱，导致细胞增殖失控;或者通过抑制p53的功能，导致凋亡反应阻抑。而INK4a/ARF基因通过重叠读码框，编码两种蛋白同时调控这两条控制细胞增殖和凋亡的通路。

　　进一步研究发现，INK4a失活的一重要原因是基因突变，最常见于胆总管癌(63%)和胰腺癌(41%)，但其中仅50%的突变影响P16Ink4a，另有50%实际上发生于外显子2，故可能同时影响P16Ink4a、P14ARF[2]。这使得以往很大一部分P16Ink4a在大肠癌中的研究变得不确切，因为可能是P14ARF而非P16Ink4a在起作用，同时由于异位表达P16Ink4a、P14ARF皆可诱导细胞周期阻滞，所以有学者认为两者都具有抑癌活性[7]。

　　我们的实验发现，在30例大肠癌中P16Ink4a蛋白表达阴性为25例，P14ARF阴性表达有14例，Spearman相关分析，未发现两者之间的表达存在相关性，这说明①两者在大肠癌的发生发展中调控途径是不同的;②以往主伙5’端CPC1(又称HTF岛)甲基化，仅仅是P16Ink4a失活的机制，但最近研究发现，P14ARF启动子中存在HTF岛，且在28%大肠癌中发现P14ARF甲级化，由于P14ARF甲基化发生于其启动子，P14ARF的甲基化与P16Ink4a是否甲基化就毫无关系，因而P14ARF是否失活与P16Ink4a的状态无关。同时，全组30例中，p16-/14+的患者有14例，p16+/14-的患者有3例，说明两者的功能并非是多余的，而是发挥着不同的作用，存在某种互补性。本文对于P16Ink4a、P14ARF在大肠癌中抑癌基因地位只是一个初步观察，解决这一争议的根本方法是需要建立一个P16Ink4a特异性剔除的大鼠模型。

　　INK4a/ARF这种双重运用编码序列的方式，见于真核生物的基因，哺乳动物经过长期的演化，仍然保存这种重迭阅读框架的方式，这就使我们不得不重新思考INK4a/ARF基因可能对肿瘤发生所起的重要作用,由此也提出了新的INK4a/ARF可能调控机制：INK4a/ARF是否采用重迭运用阅读框架的方式，通过表达不同的产物，对不同类型的肿瘤或同一种肿瘤不同阶段进行调控。

　　【参考文献】

　　[1] 范淑萍, 范开席. 大肠癌P16蛋白表达与临床病理关系. 《中国肿瘤临床》,2001,28：648-651

　　[2] Yoshida S, Todoroki T, Ichikawa Y,et al.Mutions of p16INK4/CDKN2 and p15INK4b/MTS2 Gene in biliary tract cancer. Cancer Res,1995,55:2756-2760

　　[3] Serrano M, Hannon GJ, Beach d, et al.A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4.Nature, 1993,366:704-707

　　[4] Schutte M. Abrogation of the RB/p16 tumor-supressive pathway in virtually all pancreatic carcinomas. Cancer Res,1997,57:3126-3130

　　[5] Zhang Y, Xiong Y, Yarbrough WG, et al. promotes MDM2 degradation and stabilizes p53:ARF-INK4a locus deletion impairs both the RB and p53 tumor suppression pathways.Cell,1998,92:725-734

　　[6] Freedman DA, Levine AJ. Nuclear export is required for degradation of endogenous p53 by MDM2 and human paoillomavirus E6. Mol Cell Biol,1998,18:728-7293

　　[7] Serrano M, Lee H, Chin L, Cordon-Cardo C, et al. Role of the INK4a locus in tumor suppression and cell mortality. Cell,1996,85:27-37