高迁移率族蛋白1与重症急性胰腺炎

　　作者：胡永毅,赵国海　　作者单位：241001 安徽省皖南医学院2006级研究生 241001 安徽省皖南医学院弋矶山医院急诊外科

　　【关键词】 急性胰腺炎

　　重症急性胰腺炎(SAP)病情发展迅猛，死亡率高，预后差。SAP发病后，炎性细胞因子的大量释放和过度的全身炎症反应[1]，导致全身炎症反应综合症(SIRS)，可恶化发展为多器官功能障碍综合症(MODS)、多器官功能衰竭(MOF)，构成SAP第一个死亡高峰。而胰腺坏死感染和全身脓毒症是SAP后期的主要问题，它构成SAP的第二个死亡高峰。但早期释放的炎症因子如TNF - α和IL - 1β等均在发病后迅速升高至峰值，随即迅速下降。但炎症反应和脏器损害仍在继续，提示可能有某些晚期炎症因子参与了病理过程。1999 年Wang 等[2]报道高迁移率族蛋白-1(high mobility group box chromosomal protein 1 ,HMGB1)是一种重要的晚期炎症介质参与了脓毒症的病理生理过程,介导了内毒素的致死效应。近年来大量研究结果表明HMGB1可能作为重要的晚期炎症介质参与重症胰腺炎的全身炎症反应和多器官功能不全。本综述将探讨HMGB1在重症胰腺炎中的病理生理机制。

　　1 HMGB1基因和蛋白质结构

　　图1 HMGB1蛋白结构示意图(略)

　　1973 年,Goodwin 等[3]在牛胸腺中首次提取鉴定了一种含量丰富的非组蛋白核蛋白,该蛋白分子量30 kD 左右,富含电荷,并因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率快的特性而命名为高迁移率族蛋白(HMG) 。随后研究发现HMG是一个大家族, 目前HMGB 分为三类:HMGB1 、HMGB2 和HMGB3[4] 。HMGB1 是含量最丰富的HMG蛋白,平均10～15 个核小体中含有一个HMGB1 分子。人类HMGB1基因位于13q12染色体上，包括5个外显子和4个内含子[5]。在一般环境条件下，HMGB1的表达量维持在基础水平。HMGB1基因敲除后幼鼠仍能存活，但存在广泛的形态畸形，多于出生24 小时内死亡。人类HMGB1蛋白的初级氨基酸序列中含有215个氨基酸残基，由3个独特的结构域组成(图1)。其中A-box位于N-末端，进化高度保守;C-tail在羧基末端，包含30个重复的天冬氨酸和谷氨酸残基，可参与调节HMGB1与DNA结合的亲和力;B-box位于二者之间。A-box和B-box均由3个α螺旋组成，并带有强烈的正电荷，构成HMGB1的非特异性DNA结合区。HMGB1释放至胞外后，A-box是引起炎症反应的功能结构域，而A-box对B-box有一定的拮抗作用[6]。HMGB1在不同的物种中高度保守，大鼠与小鼠的HMGB1蛋白序列完全一致，与人类HMGB1蛋白的不同点只是C末端重复序列中有2个残基被置换。

　　2 HMGB1释放和受体信号传导途径

　　2.1 HMGB1可通过两种不同方式释放到细胞外 ①由炎症细胞主动分泌;内毒素及多种炎性因子均可诱导HMGB1释放介导炎性反应。注射LPS、IL-1、TNF-α8小时后，单核巨噬细胞开始分泌HMGB1，并在随后的24小时中血清HMGB1浓度维持较高水平，这说明HMGB1是一种重要的晚期炎症介质[2]。 ②由坏死的细胞被动释放。2002年Scaffidi等[7]观察到细胞凋亡时，无HMGB1的释放也无炎症反应的发生;而反复冻融致坏死的HeLa细胞可释放核内HMGB1到细胞表面，证明HMGB1可由坏死细胞被动释放。正常情况下HMGB1 与染色质结合松散,只有当核膜通透性增高时HMGB1才易漏到核外。但细胞凋亡时细胞核内染色体组蛋白发生低乙酰化，乙酰化程度越低，HMGB1与染色体亲和力越大。因此凋亡细胞HMGB1在核内与染色质不可逆性紧密结合。在细胞崩解时HMGB1不释放到细胞外基质。而坏死发生时胞内HMGB1由染色质结合状态迅速转化为可溶状态，并释放到细胞外引起局部炎症反应，但当HMGB1大量释放可导致全身炎症反应。因此HMGB1两种释放方式都在组织坏死时发生炎症反应中起重要作用。

　　2.2 HMGB1受体信号传导途径 胞外HMGB1极具黏性可以与细胞表面多种不同分子结合，如肝磷脂、蛋白聚糖，甚至硫糖脂和磷脂等。研究发现，RAGE是目前唯一已知的HMGB1的高亲和力受体, 它是一种跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族一员，能结合多种配体且与HMGB1在细胞表面的结合可引起RAGE表达上调[8]。目前HMGB1与RAGE结合诱导细胞内的信号转导主要涉及两条通路。一条为Rac和Cdc42 途径,导致细胞骨架重建; 另一条为Ras 丝裂原活化蛋白肌酶(MAPK)途径和随后核因子κB (NF-κB)移位介导的炎性反应[9]。除RAGE外, Toll样受体2和Toll样受体4亦能作为HMGB1的受体,与其相互作用诱导细胞活化[10] 。TLR4缺陷(C3H /HeJ )小鼠对HMGB1诱导的局部缺血损伤更具有抵抗力[11]。

　　3 针对HMGB1的实验性治疗

　　目前拮抗HMGB1主要有以下几种方法：①HMGB1抗体: Hidehiro S等[12]在通过胰胆管结扎法诱发重症胰腺炎大鼠模型中，给予腹腔内注射HMGB1抗体可明显改善重症胰腺炎大鼠胰腺和胰外多器官功能。②HMGB1 A 盒(A-box) : HMGB1 A-box是一个特异性的HMGB1竞争性抑制剂，脓毒症小鼠在造模后24 h注入纯化的重组A-box，能有效抑制败血症的发展,对小鼠产生保护作用[13]。③丙酮酸乙脂(ethyl pyruvate, EP )：EP作为一种安全的食物添加剂，可通过抑制由NF - κB 和p38MAPKs介导的信号转导而影响巨噬细胞的活性,抑制巨噬细胞释放HMGB1。④HMGB1合成抑制剂-正丁酸钠：通过抑制NF-κB信号转导通路阻断细胞因子和内毒素介导的炎性反应 。另外正丁酸盐可能通过调节抑制HMGB1基因的启动子来抑制HMGB1表达。⑤抗HMGB1 B盒(B box)抗体：能明显拮抗HMGB1或者B box所致的脓毒症[6]。 ⑥天然药物、中药有效成分:中药当归、绿茶提取物山茶报春黄甙和丹参提取物丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮可呈剂量依赖性抑制LPS 诱导巨噬细胞HMGB1 的释放，减轻全身HMGB1积聚。

　　4 HMGB1 在重症急性胰腺炎中的作用及其机制

　　4.1 HMGB1作为晚期炎症介质参与SAP 的全身炎症反应 LPS 和多种细胞因子能刺激HMGB1 的释放。LPS、TNF - α、IL - 1β刺激巨噬细胞、单核细胞和垂体后叶细胞以一种时间剂量依赖方式释放HMGB1。IFN - γ能协同其它细胞因子刺激HMGB1 的合成。Wang 等[2]研究发现IFN - γ 与TNF- α或IL - 1 共同刺激则可使HMGB1 的产生增加3～5 倍。反过来HMGB1能刺激多种细胞合成、释放促炎细胞因子。HMGB1可以刺激单核巨噬细胞分泌一些促炎因子,如TNF - α、IL - 1、IL - 6、IL - 8等;与LPS相比, HMGB1引起的TNF -α分泌曲线呈双峰型,峰值分别在3 小时和8～10 小时出现,其意义在于对延长和维持炎性反应起到重要作用。 用纯化的重组HMGB1 与人外周血单个核细胞共培养, 发现HMGB1能明显刺激IFN、IL - 1α、IL - 1β、白细胞介素- 1受体拮抗剂(IL- 1RA) 、IL - 6、IL - 8、巨噬细胞炎症蛋白- 1α (MIP - 1α) 和MIP - 1β的产生。HMGB1刺激嗜中性粒细胞表达多种促炎细胞因子如TNF - α、IL- lβ、IL - 8，并能引起NF -κB的核移位。还能诱导树突细胞成熟并产生多种促炎细胞因子。采用胰管逆行灌注人工胆汁的方法复制大鼠SAP模型，观察重症急性胰腺炎大鼠血清 TNF-α 、 IL-1β 和HMGB1 水平的时相变化,发现SAP大鼠血清TNF-α和IL-1β水平在建模后迅速升高, 约在4～6小时达高峰, 之后迅速下降, 在12小时后即降至接近正常水平, 一直维持至24～48小时。而血清HMGB1 水平在建模后12小时开始有明显升高, 至24～48小时仍维持在较高水平。该实验表明HMGB1作为晚期炎症介质参与SAP的全身炎症反应。

　　因此,当SAP组织细胞坏死或受损时,核内的HMGB1释放至胞外,激活免疫反应和炎性反应,引起单核巨噬细胞等分泌促炎因子;而促炎因子又可以反过来促进HMGB1的分泌,这样就形成了一个正反馈环路,从而使炎症反应不断得以放大、加重。在炎性反应的后期,这种正反馈效应对SAP全身炎性反应的维持起到了相当重要的作用。

　　4.2 HMGB1 对肠粘膜屏障功能的损害作用 正常时肠粘膜屏障功能保护机体免受各种病原体的入侵。HMGB1 能影响肠粘膜生物屏障功能。实验显示,HMGB1 以及B-box 能以一种时间剂量方式增加培养的Caco-2 肠细胞的通透性,并可损害小鼠肠粘膜,导致肠道菌群移位 。进一步研究显示,HMGB1 促使肠粘膜通透性的增加与NO 或ONOO- 生成有关。通过药物抑制或清除NO 的生成与表达能废除B-box诱导的肠通透性增高。HMGB1 不能改变iNOS 敲除小鼠肠粘膜通透性。实验发现SAP大鼠肠组织中HMGB1 表达于建模后6～12 小时才明显增高, 24小时后肠组织中HMGB1 水平达峰值并持续至48小时。血浆D- 乳酸与肠组织MPO 水平在24小时达最高值，同时肠组织病理损害随着时间的延长而逐渐加重。经EP治疗后，肠组织HMGB1表达水平明显低于SAP组，肠组织病理损伤明显减轻，肠黏膜屏障功能得以明显改善。说明SAP 时HMGB1 作为晚期炎症介质介导了肠黏膜屏障功能不全的发生与发展。

　　4.3 HMGB1介导SAP晚期脓毒症的致病过程 HMGB1具有自身毒性作用。当HMGB1血清浓度达100～300 ng/ml即可产生毒性，动物实验显示，给纯化重组HMGB1(每只l0～50 ug)攻击Balb/C小鼠，2小时内小鼠出现典型内毒素血症样症状，36小时后50ug剂量组小鼠大部分死亡，且重组HMGB1与内毒素联合应用时致死性更强;内毒素敏感小鼠(C3I-I/HeN)和耐受小鼠(C3H/HeJ)注射重组HMGB1(每只500 ug)，两组动物16 h内均全部死亡。表明HMGB1介导的致死性与内毒素无关。给予抗HMGB1抗体，可明显降低小鼠死亡率，且在内毒素攻击2 h后注射HMGB1抗体，仍对致死量内毒素攻击小鼠产生显著的保护作用。用带有缺陷HMGB1cDNA转化来的大肠杆菌中提纯出来的蛋白质片段给予对照组小鼠，则未出现内毒素血症情况，证明观察到的毒性反应是HMGB1所特有的。提示HMGB1自身即可诱导脓毒症发生。追踪观察了64例脓毒症患者144 h,血清HMGB1水平持续升高,在测试结束时, TNF - α、IL - 6、IL - 8、IL - 10等细胞因子水平已很低,而HMGB1的浓度却高出它们的300倍。临床报道重症胰腺炎病人血浆HMGB1水平高于正常组，并发全身感染和多器官功能不全的病人HMGB1水平显著升高，且死亡组血浆HMGB1水平明显高于存活组，治愈后HMGB1水平逐渐下降至正常水平。与TNF -α及IL - 1等早期炎性细胞因子明显不同,循环HMGB1在SAP后期升高,持续时间明显延长,有可能作为一种“晚期”炎症介质参与SAP晚期脓毒症致病过程。

　　4.4 HMGB1 对SAP微循环相关因素的影响 血管内皮细胞是一种多功能细胞,除屏障、物质转运作用外,还可与白细胞相互作用参与炎症的调控。发现,重组的人HMGB1 与微血管内皮细胞共同孵育,HMGB1 能够以时间剂量依赖方式增加ICAM- 1、VCAM - 1 和RAGE 的表达;促使TNF、IL - 8、MCP - 1、PAI - 1 和t - PA 分泌; 使P38MAPK激酶、ERK激酶、JNK激酶磷酸化并使核转录因子NF -κB 和Sp1 发生核移位。HMGB1 还能与t - PA、纤溶酶原结合,促进纤维蛋白溶酶的产生,导致纤溶系统活化,从而在细胞受损和组织重建中起到重要作用。HMGB1 还能够活化金属蛋白激酶MMP - 2、MMP - 9 ,它们是纤溶酶活化反应的下游靶分子。人血小板活化时,作为血小板内源性蛋白胞浆中的HMGB1 被分泌至血小板表面并可导致血小板变形,影响血小板功能。用伊文氏蓝(EBD)作为蛋白示踪剂，观察丙酮酸乙酯(EP)对SAP大鼠全身毛细血管渗漏(SCL)的影响，发现建模后24小时,EP 组血清HMGB1 浓度明显低于SAP 组，EP 组大鼠腹水量、肺系数、肺湿/ 干比明显低于SAP 组 ，EP 组大鼠胰腺、空肠、回肠和耳廓组织EBD 含量明显低于SAP 组。研究结果显示SAP大鼠血清HMGB1水平的降低伴随着毛细血管液体和蛋白渗漏的明显改善, 证明了HMGB1 水平的升高是SAP 大鼠SCL 发生的因素之一。

　　4.5 HMGB1对多器官功能不全的影响 近年来有大量研究发现HMGB-1与重症胰腺炎并发胰外多器官功能不全有密切关系。2006年报道重症胰腺炎的病人血浆HMGB1水平明显升高，且与血浆乳酸脱氢酶、C-反应蛋白、总胆红素和Glasow评分呈正相关。并发感染和多器官功能不全的病人HMGB1水平显著升高，且死亡组明显高于非死亡组。在SAP大鼠实验模型中发现，HMGB-1抗体可以降低血清淀粉酶、 丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶 、乳酸脱氢酶、尿素氮和肌酐水平，并明显改善胰腺和肺组织病理变化[12]。SAP大鼠胰腺组织HMGB1 mRNA表达水平在建模后12h明显升高,至24h仍维持在较高水平，HMGB1抑制剂正丁酸钠能降低重症胰腺炎大鼠胰腺组织HMGB1基因和蛋白表达水平,从而减轻重症胰腺炎大鼠胰腺组织的损伤。SAP大鼠血浆AST、ALT 水平升高的同时，大鼠肝组织HMGB-1 mRNA表达明显增加，伴HMGB-1蛋白在肝细胞和枯否细胞表达增强，表明SAP大鼠肝组织HMGB-1 表达升高参与了肝损伤的病理生理过程。SAP大鼠肺组织HMGB-1 mRNA表达水平在建模后12小时明显升高, 至24小时仍维持在高水平, 伴动脉血氧分压进行性降低。而此时血清中TNF - α、IL - 1β水平已明显下降。经丙酮酸乙酷治疗后大鼠肺组织HMGB-1 mRNA水平均明显低于SAP组，伴动脉血氧分压升高，且肺组织损伤明显减轻。还发现延迟的EP治疗能有效降低SAP大鼠血清HMGB1水平。EP组血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、尿素氮和肌酐水平以及肺湿/干比和组织学评分均明显低于SAP组。 表明延迟的EP治疗可以通过下调血清HMGB1水平减轻SAP大鼠胰外脏器损伤。以上研究结果表明HMGB1很可能参与SAP晚期多器官功能损害的致病过程。

　　5 结语

　　HMGB1作为晚期炎症介质参与了SAP和SIRS的发病过程，它的促炎功能和特点使它比一些早期炎症介质更具有潜在的临床研究价值。对防治SAP起到积极的作用。目前研究尚处于初级阶段，许多机制尚不清楚,如HMGB1的合成、释放调节机制, HMGB1介导细胞活化、信号转导和分子机制等，以及是否还存在其他类似的晚期炎症介质，HMGB1合成释放的具体调节机制、高效特异的干预方法等问题都有待于进一步研究以上问题的解决必将为SAP提供新的研究理论及有效的防治措施。

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