原发性肝癌患者血清p53抗体和甲胎蛋白与临床特征的关系

　　作者：李洪庆,武俊芳,杨廷桐,张艳芳,李磊　　作者单位：1.沁阳市西万医院普通外科，河南 沁阳 454100;2.新乡医学院形态学实验室，河南 新乡 453003

　　【摘要】目的 探讨原发性肝癌(PHC)患者血清p53抗体和甲胎蛋白(AFP)与临床特征的关系。方法 用酶联免疫吸附(ELISA)法定量分析52例肝癌患者首诊时血清p53抗体和AFP含量,并用单因素和多因素统计方法分析与性别、饮酒史、乙肝表面抗体(HbsAg)、病理诊断、肿瘤分化程度、肝硬化、肿瘤生长方式、有无肝外转移等的相关性。结果 52例PHC血清p53抗体阳性率30.77%(16/52)。单因素分析显示,血清p53抗体阳性与肿瘤分化程度低(P=0.017)及肝外转移(P=0.03)有关。AFP阳性率为44.23%(23/52),p53抗体与AFP共表达率为15.40%，一致性为55.80%。结论 血清p53抗体阳性与PHC的不良生物学特征有关，p53抗体与AFP联合检测对肝癌的早期诊断有重要的价值。

　　【关键词】 p53抗体;甲胎蛋白;原发性肝癌;临床特征

　　基金项目：河南省教育厅资助项目(编号：2006310024)

　　Relationship between serum antip53 antibody/alpha fetoprotein and clinical characteristics of primary hepatic carcinoma　　LI Hongqing,WU Junfang,YANG Tingtong,et al　　1.Xiwan People′s Hospital,Qinyang 454100,China;　　2.Laboratory of Morphology,Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003，China

　　Abstract: Objective To study the relationship between clinical characteristics and the level of serum antip53 antibody and alpha fetoprotein (AFP) in patients with primary hepatic carcinoma(PHC).Methods The level of serum antip53 antibody and AFP in 52 patients with PHC was detected by the enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).Results The positive rate of p53 was 30.77%(16/52),Univariate analysis showed that the positive status of serum p53 antibody was associated with neoplastic differentiation degree(P=0.017) and remote metastasis(P=0.03).The positive rate of AFP was 44.23%(23/52),the coexpression of p53 and AFP were 15.40%,and the concordance were 55.80%.Conclusion The positive status of serum p53 antibody may be associated with the malignant biological features of PHC.The associated detection of serum p53 and AFP is important to the early diagnosis in PHC.

　　Key words: antip53 antibody;alpha fetoprotien;primary hepatic carcinoma;clinical characteristics

　　原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)起病隐匿,恶性程度高,大部分患者发现时已属中晚期,失去外科手术机会。目前尚无满意的早期诊断和评估预后的指标。人类肿瘤中,p53突变是最常见的基因改变。常发生于多种恶性肿瘤的形成过程中[1],突变型p53蛋白作为免疫系统的靶抗原在细胞内积聚,表达异常的p53蛋白,刺激机体产生自身体液免疫,并可在患者血清中检测到p53抗体[23]。国内外已有PHC患者血清p53抗体的研究,但出现了相互矛盾的结论[4]。本研究通过检测PHC患者的血清p53抗体及甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)的水平,旨在进一步分析和探讨p53抗体与PHC诊断的临床关系及应用价值。　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　2004年2月至2006年12月在新乡医学院第三附属医院和新乡市中心医院被确诊为PHC的患者52例,男38例,女14例;年龄32~65岁，平均(47.5±0.15)岁。均符合PHC临床诊断标准[5]，临床病史资料完整，其诊断均经B超、CT及肝穿刺取组织病理学得到证实。另外非PHC患者(肝炎5例，肝硬化5例，肝脓肿2例)12人。

　　1.2 仪器及试剂

　　仪器： TDL 802B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);隔水式电热恒温培养箱PYXDHS 40×50BS、DNM9602型酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司);Nikon E200型双目显微镜(日本)。试剂：p53抗体检测试剂采用德国IBL公司p53AutoantibodiesELISA试剂盒。AFP试剂采用美国Bayer公司AFP试剂盒。

　　1.3 检测方法

　　标本为PHC患者和非PHC患者。取患者清晨空腹时静脉血液2 mL，并立即放入抗凝血试管中,立即离心后取上清液,放置于-20 ℃冰箱中保存、待测。标本收集完毕后,在24 ℃室温下,应用antip53 ELISA检测试剂盒,严格按说明书进行操作:洗涤重组p53蛋白或质控蛋白包被的聚苯乙烯微量反应板,将稀释的样本和质控蛋白各100 μL分别加入到相应的反应板微孔内,20 ℃~25 ℃震荡温育1 h,取出后吹干,加入过氧化物酶标记的抗人IgG抗体反应液100 μL,20 ℃~25 ℃震荡温育1 h,再次洗涤4次后吹干,加入酶反应底物TMB 100 μL,室温避光反应10 min,加入100 μL H2SO4终止酶反应。用酶标仪测定450 nm波长的吸光度。根据标准曲线,按照公式计算出血清p53抗体半定量值(kU•L-1),并按照试剂盒给出标准确定血清p53抗体阴性、阳性值。血清p53抗体水平表达参数确定：指数=(样品p53蛋白净吸光值-质控蛋白吸光值)/(低值阳性质控p53蛋白净吸光值-质控蛋白吸光值)。AFP检测方法：按照AFP试剂盒说明书方法进行。主要步骤：稀释液100 μL,样本20 μL,37 ℃ 30 min,洗板4次，酶标抗体150 μL,37 ℃30 min,,洗板3次，显色，酶标仪测定，打印数据。

　　1.4 判定标准

　　阳性：p53抗体指数>0.428;AFP≥400 μg•L-1。阴性：p53抗体指数≤0.428;AFP<400 μg•L-1。

　　1.5 统计学处理

　　结果采用χ2检验和秩和检验分析，在SSPS 11.5软件包上运行。P<0.05具有显著性。

　　2 结果

　　2.1 血清p53抗体与临床特征的关系

　　血清p53抗体阴性者36例，阳性者16例;血清p53抗体与临床特征关系经过统计分析，与性别、饮酒史、HbsAg、肝硬化、生长方式、AFP无关，只与有无肝外转移有关(P=0.03)，见表1。表1 52例原发性肝癌患者血清p53抗体与临床特征的关系 (略)

　　2.2 血清p53抗体与病理诊断的关系

　　PHC患者血清p53抗体阴性者36例，阳性者16例;非PHC血清p53抗体阴性者9例，阳性者3例;血清p53抗体与PHC和非PHC的关系，经过统计学处理无显著性差异(χ2=0.000，P=1.00)，见表2。表2 p53抗体与病理诊断的关系(略)

　　2.3 p53抗体与肿瘤分化程度的关系

　　血清p53抗体阴性者36例，阳性者16例;在PHC中p53抗体与肿瘤的分化程度经统计学处理有显著性差异(P=0.017)，高与中比P=1.000，高与低比P=0.022，中与低比P=0.027，说明p53抗体与肿瘤的分化程度相关。见表3。表3 52例原发性肝癌患者p53抗体与肿瘤分化程度的关系(略)

　　2.4 血清p53抗体与AFP的检测比较

　　血清p53抗体阴性者36例，其中，AFP阴性者21例，AFP阳性者15例;血清p53抗体阳性者16例，其中，AFP阴性者8例，AFP阳性者8例;在PHC中p53抗体与AFP之间经过统计学分析无显著性差异P=0.577。p53与AFP的共表达率为15.4%，一致性为55.8%。见表4。表4 52例原发性肝癌患者血清p53抗体与AFP的检测比较(略)

　　3 讨论

　　突变的p53基因表达突变的p53蛋白,不能进行DNA修复和控制细胞分裂,另一重要特点是突变的p53蛋白的半衰期由野生型的20 min增长到数小时之久,并在肿瘤细胞核内积聚[6]。积聚于细胞核中的突变p53蛋白,在细胞坏死裂解后进入体液,导致机体对这一蛋白产生自身体液免疫,从而产生了p53抗体。 在正常人的血清中p53抗体呈现阴性[4]。良性疾病中,极少检测到p53抗体,阳性率明显低于恶性肿瘤患者[9]。如果临床检测p53抗体阳性,应高度疑诊恶性肿瘤。许多研究发现，p53抗体出现与p53蛋白积聚以及p53基因突变有明显相关性,因而可以由血清中p53抗体状态推测机体有无p53基因突变[7]。从而早期的作出对肿瘤诊断的可能性。

　　Crawford[8]1982年,首先在乳腺癌患者中发现并描述了p53抗体。近年来,国内外研究显示,p53抗体作为一种新型的、应用于临床肿瘤诊断的、极有潜力的肿瘤标志物,正受到人们的极大关注。通常认为,p53抗体阳性与肿瘤分化低、分期晚、化疗耐药等提示肿瘤恶性生物学行为的指标有关[10],本研究显示,血清p53抗体对诊断恶性肿瘤有较高的特异性。

　　关于p53抗体在预后中的价值,研究者持有不同观点[9]。本研究分析了52例PHC患者,p53抗体阳性率30.77%,分析显示血清p53抗体阳性与患者的性别、年龄、饮酒史、HBsAg、有无肝硬化、生长方式等均无关,而与患者肿瘤分化程度、肝外转移有关，与国外研究相似[11]。单因素分析显示,病理分化程度为低分化者p53抗体阳性率明显高于高分化和中分化者。肿瘤分化越低,p53抗体阳性率越高，结果提示：血清p53抗体的高低,预示了肿瘤分化程度、恶性度、侵袭力和预后。基础研究也发现，p53基因突变率在分化较差的肝癌中更高,在肿瘤晚期比在早期更多地出现p53基因突变。Bergqvist[12]也发现肺癌患者的血清p53抗体与肿瘤分化、TNM分期有密切关系,而与肿瘤病理类型、肿瘤大小、部位无关。

　　AFP是公认的PHC敏感性、特异性较高的肿瘤标志物,但有30% PHC患者的AFP在正常范围内,而且当AFP增高时需要排除妊娠、生殖细胞肿瘤等[13]。本实验按PHC的诊断标准[5],用配对卡方检验比较AFP阳性率与p53抗体阳性率，虽然p53抗体敏感性较低,阳性率为30.77%(16/52)，AFP阳性率为44.23%(23/52)，但按照现有样本和检验水准,尚不能认为AFP检出率高于p53抗体阳性率。

　　本研究进一步分析数据发现,在AFP阴性的29例患者中,有8例p53抗体阳性。在p53阴性的38例患者中,有15例AFP抗体阳性。同时,分子生物学研究也发现,p53基因的突变可能出现在肝细胞癌变过程的早期,并随肿瘤发展,逐渐升高,本研究显示，p53与AFP共表达率为15.4%，一致性为55.8%。因此,可以利用p53抗体的高特异性[10],在PHC诊断上可以与AFP互补,有助于AFP阴性患者的诊断;同时,对于AFP阳性的患者,p53抗体阳性可以提高PHC诊断的把握度。提示p53抗体与AFP联合检测早期肝癌及晚期肝癌的阳性率更明显高于单独检测阳性率。

　　p53抗体多数属于IgG,少数属于IgM,其理化性质非常稳定,在-80 ℃长期保存,对抗体活性无影响。良好的稳定性,使其便于临床应用[14]。采用ELISA测定血清p53抗体,方法简便,取材容易,不需癌组织标本,无创,费用低，可成为p53基因突变检测的替代和补充手段。因此，检测血清p53抗体可作为PHC诊断甚至早期诊断以及疗效观察的可靠标志物,在对PHC预后的评估上也具有一定的临床意义。

　　【参考文献】

　　[1]杨廷桐，李秀杰，张 俊,等.小细胞肺癌组织中基因改变的研究[J].实用癌症杂志,1998，52(4)：252254.

　　[2]Volkmann M,Sinn HP,Gaugel D，et al.Antip53 in breast cancer:concordance of different assay procedures and association with p53 antigen expression[J].Oncology,2002,63(3):297305.

　　[3]Bergstrom S,Dreilich M,Wagenius G,et al.The presence of antip53 antibodies in sera from patients with oesophageal carcinoma:correlation to treatment,tumour volume and survival[J].In Vivo,2004,18(5):615 620.

　　[4]Pascual S,Zapater P,Such J,et al.Comparison of staging systems to predictsurvival in hepatocellular carcinoma[J].Liver Int,2006,26(1):673679

　　[5]杨炳辉，夏景林.“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”及说明[J].肿瘤杂志，2002,1(1)：7576.

　　[6]Casey G,Lopez ME,Ramos JC,et al.DNA sequence analysis of exons 2 through 11 and immunohistochemical staining are required to detect all known p53 alterations in human malignancies[J].Oncogene,1996,13(9):19711981

　　[7]Chang SC,Lin JK,Lin TC,et al.Genetic alteration of p53,but not overexpression of intratumoral p53 protein,or serum p53 antibody is a prognostic factor in sporadic colorectal adenocarcinoma[J].Int J Oncol,2005,26(1):6575.

　　[8]Crawford LV,Pim DC,Bulbrook RD.Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer[J].Int J Cancer,1982,30(4):403408.

　　[9]Neri M,Betta P,Marroni P,et al.Serum antip53 autoantibodies in pleural malignant mesothelioma,lung cancer and nonneoplastic lung diseases[J].Lung Cancer,2003,39(2):165172.

　　[10]Nasif WA,Lotfy M,ElSayed IH,et al.Implications of CEA and p53 overexpression in the poor prognosis of colorectal cancer[J].Med Oncol,2006,23(2):237244.

　　[11]Charuruks N,Tangkijvanich P,Voravud N,et al.Clinical significance of p53 antigen and antip53antibodies in the sera of hepatocellular carcinoma patients[J].J Gastroenterol,2001,36(12):830836.

　　[12]Bergqvist M,Brattstrom D,Larsson A,et al.The role of circulating antip53 antibodies in patients with advanced nonsmall cell lung cancer and their correlation to clinical parameters and survival[J].BMC Cancer,2004,14(4):66.

　　[13]Kashyap R,Jain A,Nalesnik M,et al.Clinical significance of elevated alphafetoprotein in adults and children[J].Dig Dis Sci,2001,46(8):17091713.

　　[14]赵 峰，周清华，王兰兰.检测肺癌患者血清p53抗体的临床意义[J].中国肿瘤临床,2002,29(8):551553.