CD4+CD25+调节性T细胞在胃癌患者的表达及其临床意义

　　作者：雷晓,余佩武,赵永亮,石彦,饶芸　　作者单位：第三军医大学西南医院普通外科,重庆400038

　　提　要:目的　研究胃癌患者肿瘤组织、淋巴结及外周血中CD4+、CD25+调节性T细胞(T regulatory cells,Treg)的表达情况与胃癌临床病理的关系并分析其意义。方法　胃癌患者肿瘤组织、淋巴结、外周血及对照组中Treg表达情况分别以冰冻切片荧光抗体染色、流式细胞仪进行检测,结合胃癌患者临床病理情况分析。结果　健康成人对照外周血Treg表达率为(4. 1±5. 7)%,胃癌患者外周血Treg表达显著增高(16. 8±7. 9)%。胃癌组织Treg表达为(6. 5±7. 2)%,胃癌周围淋巴结Treg比例为(8. 4±7. 2)%,均较对照组显著增高。胃癌外周血和淋巴结Treg表达与淋巴结转移率和TNM分期有着负相关性,淋巴结转移阳性和TNM分期越晚,Treg表达率越高。结论　Treg在胃癌患者的瘤组织、淋巴结及外周血中表达较对照组显著增高,并与临床病理存在显著相关性。

　　关键词:胃癌,调节性T细胞

　　Abstract:Objective　To investigate the levels ofCD4+and CD25+regulatory T cells(Treg)and itsclinical significance in gastric cancer patients.Methods　Tumor tissue,para-gastric lymph nodes and peripheralbloodwere used to detect the levels ofTregwith immunofluorescence and flowcytometry. Another10 samples of lymph nodes from benign gastric diseases served as contro.l The Treg expression levelswere analyzedwith clinicalpathological information.Results　CD4+andCD25+cellswere observed in allgastric tissues andlymph nodes from gastric patients and controls. Te expression level ofTreg in control peripheral blood was(4. 1±5. 7)%,much lower than that[(16. 8±7. 9)%]of gastric cancer patients. Treg level in gastriccancer tissue and lymph nodes were(6. 5±7. 2)% and(8. 4±7. 2)%,both higher than that[(1. 8±2. 2)%, (1. 5±3. 1)%]in contro.l The expression levelofTreg in gastric cancerperipheralblood and lymphnodewere correlated negatively with lynph node metastasis and TNM classification.Conclusion　Treg levelrose significantly in gastric cancer tissues and correlatedwith clinical informations,indicating the immune stateofgastric cancer patients.

　　Key words:stomach carcinoma;T regulatory cell

　　调节性T细胞(T regulatory cells,Treg)是1995年Sakaguchi等[1]首先报道,在小鼠外周组织淋巴组织(脾脏、肠系膜淋巴结)等部位中存在具备特殊负调节功能的淋巴细胞,表达IL-2受体α链(CD25),占CD4+T细胞比例约为5% ~10%,能以抗原非特异方式抑制效应T细胞活化,被称为“天然发生的抑制性细胞”(natural accruing T regulatory cells)。此后发现人外周血中存在免疫表型特点为CD4+CD25+CD45RO+的Treg[2]。研究表明,Treg有维持免疫稳态的重要作用,其数量和功能的异常可能对机体造成严重影响。系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病可伴随Treg表达降低[3 4],而肺癌、卵巢癌、结肠癌及食管癌等患者外周血中Treg表达增高[5]。但目前文献中尚少见Treg在胃癌组织、胃癌淋巴结表达的报道,也少见胃癌Treg表达临床意义的报道。我们采用荧光抗体冰冻切片染色、单克隆抗体流式细胞仪技术检测了胃癌患者外周血、肿瘤组织及肿瘤周围淋巴结中CD4+CD25+Treg表达,分析其与临床病理关系,以期对Treg在胃癌患者的表达状况及意义进行初步分析。

　　1　材料与方法

　　1. 1　临床资料

　　对照组血标本取自本院血站健康成人献血者,共30例。其中男性19例,女性11例,年龄(38±12. 8)岁。抽取外周静脉血1 ml肝素抗凝送检。胃癌外周血标本取自2003年4月至2005年3月我科住院手术患者,共获45例。其中男性37例,女性8例,年龄(54±10. 2)岁。术后病理检查发现,肿瘤位于胃底部21例,胃体部15例,胃窦部9例;肿瘤分化程度上,高分化4例,中分化19例,低分化(包括低分化腺癌和黏液腺癌)22例;肿瘤浸润深度上,浸润黏膜及黏膜下层3例,肌层16例,浆膜面26例;肿瘤淋巴转移阳性者39例,阴性6例;TNM分期上,Ⅰ期2例,Ⅱ期7例。Ⅲ期15例,Ⅳ期21例。采血方法同对照组。

　　胃癌组织标本于术中切取,避开坏死、出血及脂肪组织,取肿瘤1 cm3组织2块,生理盐水冲洗送检。取远离肿瘤病灶的正常胃黏膜为对照组组织。胃癌淋巴结标本取自术中切下胃癌标本,每例于胃标本网膜中摘取淋巴结3枚,生理盐水冲洗送检。共45例。对照组淋巴结取自同期因非肿瘤性疾病行胃大部切除标本中的淋巴结,共10例。其中胃溃疡穿孔5例,胃良性溃疡2例,十二指肠球部溃疡3例;男8例,女2例,年龄(41±12. 5)岁。取材及处理方法与胃癌标本相同。

　　1. 2　方法

　　1. 2. 1　胃癌组织、癌周淋巴结及对照组Treg表达荧光显微镜观察

　　胃癌组织及对照组胃黏膜、胃癌周围淋巴结及对照组淋巴结均以液氮冻结、冰冻切片机切8μm片,室温干燥1 h,4℃丙酮固定10 min, PBS洗涤后滴加FITC-labeledAnti-HumanCD4及PE-labeled Anti-Human CD25各5μl( Immunotech),37℃、避光15 min, PBS洗涤5 min×3次,荧光显微镜观察。

　　1. 2. 2　外周血、肿瘤组织及淋巴结Treg流式细胞仪检测

　　抗凝外周血100μl以红细胞裂解液处理, PBS洗涤;肿瘤组织剪碎, 37℃消化2 h(含1 mg/ml胶原酶、2. 5 U/ml透明质酸酶、0. 1 mg/mlDNase),尼龙网过滤、淋巴细胞分离液离心,吸取界面层细胞, PBS洗涤;淋巴结在无菌钢网(100目)内研磨成细胞悬液,尼龙网过滤, PBS洗涤。上述细胞加入FITC-anti human CD4、PE-anti human CD25各5μ,l振荡混匀,室温避光15 min。对照加入等量FITC-anti human IgG、PE-anti humanIgG, PBS稀释,上机检测。

　　1. 3　统计学处理

　　数据以-x±s表示,采用SPSS 10. 0统计程序进行独立样本t检验及spearman等级资料相关性分析。

　　2　结果

　　2. 1　胃癌与对照组的胃组织、外周血、淋巴结中Treg表达对比

　　镜下观察发现,在胃癌组织和对照组胃组织、胃癌周围淋巴结和对照组淋巴结中有明显CD4+细胞荧光,也有CD25+细胞荧光表达。胃癌组织中CD4+细胞荧光的数量和强度与对照组胃组织类似,而CD25+细胞荧光的数量和强度均高于对照组胃组织(图1)。观察也发现,胃癌周围淋巴结中CD4+细胞荧光的数量与强度与对照组胃淋巴结类似,而CD25+细胞荧光的数量和强度均高于对照组淋巴结(图2)。

　　图1　胃癌组织(低分化腺癌)与对照组胃组织CD4+及CD25+细胞荧光表达　(免疫荧光×400)

　　图2　胃癌(低分化腺癌)周围淋巴结与对照组淋巴结CD4+及CD25+细胞荧光表达　(免疫荧光×400)

　　流式细胞仪检测发现,胃癌患者外周血CD4+CD25+Treg表达率为(16. 8±7. 9)%,健康对照组外周血Treg表达率为(4. 1±5. 7)%。胃癌患者外周血Treg表达率较健康对照组外周血Treg表达率增高非常显著(t= 3. 728,P<0. 01)。检查发现,胃癌组织中Treg表达率为(6. 5±7. 2)%,对照组胃组织中Treg表达率为(1. 8±2. 2)%。胃癌组织中Treg表达率较对照组胃组织Treg率增高非常显著(t= 3. 628,P<0. 01)。胃癌周围淋巴结中Treg表达率为(8. 4±7. 2)%,对照组淋巴结中Treg表达率为(1. 5±3. 1)%。胃癌周围淋巴结Treg表达率较对照组淋巴结Treg表达率增高非常显著(t= 3. 691,P<0•01)。

　　2. 2　胃癌各部位Treg表达水平的临床意义

　　将胃癌各部位Treg表达率与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、病理分化程度及肿瘤浸润深度情况间进行分析,结果显示胃癌Treg表达在不同年龄、性别、肿瘤部位、病理类型及肿瘤浸润深度间无显著差异。

　　进一步分析发现,胃癌Treg表达高低与胃癌淋巴结转移有关,有淋巴结转移者,胃癌外周血Treg表达率显著高于无淋巴结转移者(P<0. 05)。胃癌淋巴结和胃癌组织Treg表达率在不同淋巴结转移情况间未见差异显著性(表1)。

　　胃癌患者外周血及胃癌周围淋巴结Treg表达率在Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者,Treg表达率均显著高于Ⅱ期+Ⅰ期胃癌患者(P<0. 05)。相关性分析显示,胃癌患者外周血及淋巴结Treg表达,与胃癌TNM分期显著相关(r=0•529,P<0. 05),TNM分期越晚,Treg表达越高。进一步分析胃癌患者外周血与胃癌淋巴结中Treg表达率相关性,结果显示二者相关性非常显著(r=0•742,P<0. 01) (表1)。

　　表1　胃癌不同病理情况间Treg表达率分析[(-x±s)%]

　　肿瘤淋巴结转移TNM分期

　　阳性阴性Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期

　　外周血17. 2±9. 6a14. 5±11. 3 13. 7±5. 1b15. 8±4. 7 18. 4±5. 7

　　周围淋巴结16. 9±10. 4 15. 1±11. 7 14. 2±7. 6c16. 2±5. 2 18. 2±9. 5

　　a:t=2. 57,P<0. 05,与阴性比较;b:t=-1. 63,P<0. 05,与Ⅲ

　　期比较,t=-2. 78,P<0. 05,与Ⅳ期比较;c:t=-1. 24,P<0•05,与Ⅲ期比较,t=-3. 27,P<0. 05,与Ⅳ期比较

　　3　讨论

　　研究表明,正常情况下机体内Treg的免疫学意义是维持机体免疫稳态,其作用方式是动态调节机体免疫平衡,有防止免疫反应无限制扩大及抑制自身免疫反应发生的作用。体内Treg的数量和功能状态对机体免疫稳态的维持有重要意义,理论上Treg数量过少或功能不足,会导致免疫反应无法有效控制,出现相应的免疫性损害,甚至出现自身免疫性疾病。这种情况已在很多疾病中得到证实。但Treg数量过多或功能过强的情况不多,目前还主要在肿瘤患者上有报道。

　　虽然Treg与恶性肿瘤免疫抑制的关系尚不明确。但研究表明,体内对抗Treg的处理措施,明显有益于机体抗肿瘤免疫。在动物肿瘤模型研究中发现,经抗CD25单抗预处理的小鼠,可显著减少种植后骨髓瘤、肉瘤的生长率。但如果肿瘤种植2 d后,再使用单抗对肿瘤生长不产生影响。已有肿瘤生长的小鼠,如果再剔除CD4+、CD25+T细胞后,小鼠脾脏细胞中可产生强烈的抗肿瘤特异性CD8+T细胞及非特异NK细胞[6, 7]。因此。Treg在肿瘤情况下表达增高,显然存

　　在有不利于机体抗肿瘤免疫的作用。研究Treg在机体中的表达情况,对于机体尤其是带瘤机体的免疫状况有一定的说明意义。

　　Treg在机体内应该是维持一定水平的,因此在正常人外周血中能够检测到Treg表达,其表达水平可在一定程度上反映机体的免疫状况。但是,即使对于健康成人外周血的Treg水平,目前尚没有进行大规模普查,不同作者报道的表达值不尽相同,Dieckmann[8]报道为2. 8% ~17. 2%, Ichihara等[9]报道为7. 2%,Jonuleit等[10]报道0. 7% ~5. 5%。Baecher-Allan等[2]报道为10%,且认为Treg可以进一步划分为CD25高表达和CD25低表达两类, CD25高表达Treg大约占CD4+T细胞1% ~2%,CD25低表达Treg最高大约占到CD4+T细胞的16%。这些报道均存在检测样本量较少的缺点,其数值不能代表Treg的正常值,只能说明其大致范围和相对变动情况。因为Treg在体内是处于动态平衡,可能随内外环境变化而出现较大范围的变动。为了解Treg在健康成人的外周血中表达情况,我们检测了30例健康成人外周血的Treg表达率,结果为0. 9% ~9. 7% (4. 1±5. 7)%,与其他研究者报道类似,说明本研究所得结果基本属于正常表达范围,可以作为深入研究的对照基础。

　　为了解肿瘤局部的免疫状况,对于胃癌患者,我们分别研究了Treg在肿瘤组织及肿瘤引流淋巴结中的表达情况,结果显示,相对于健康成人、非肿瘤性病变胃周淋巴结及正常胃黏膜组织,胃癌患者外周血、胃癌引流淋巴结及胃癌组织中Treg表达率增高非常显著。这一结果说明,胃癌患者可能存在较广泛的Treg表达增高现象,也间接地说明Treg在胃癌免疫中可能有重要的意义,值得深入研究。联系患者基本资料及病理资料进行统计分析,结果显示,不同的患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度和肿瘤浸润深度间,未能发现各部位Treg表达的显著性差异。这一结果说明,以上情况可能不是影响胃癌患者Treg表达水平的主要因素。

　　由于胃癌患者淋巴结转移情况对胃癌患者预后可能存在显著影响[11],因此我们对不同胃癌淋巴结转移情况间的Treg表达进行对比研究,结果显示淋巴结转移阳性者Treg表达率显著高于淋巴结转移阴性者。目前对Treg的肿瘤情况下分布研究很少,本研究表明,胃癌肿瘤组织中经过酶消化、提取淋巴细胞进行Treg分析发现较正常黏膜显著增高。以上结果说明,Treg可能在胃癌肿瘤组织局部和胃癌周围淋巴结中大量表达,对胃癌局部免疫有一定影响。

　　对于胃癌各部位Treg表达与临床病理资料进行相关性分析,首先我们注意到,胃癌患者外周血Treg表达与淋巴结Treg表达间存在显著相关性,二者呈现399同步增高现象。该结果进一步说明胃癌患者存在淋巴循环,其全身淋巴结在Treg表达率上可能具备统一性,也间接说明实验研究中因淋巴结选取部位不同造成的Treg表达率误差可能性较小,其结果较为可信。其次,分析还显示,虽然胃癌淋巴结转移阳性患者引流淋巴结Treg表达率相对于转移阴性者无明显差异,但淋巴结转移阳性者其外周血Treg表达显著增高。这一结果可能说明,胃癌局部引流淋巴结中Treg表达已经达到一定的平台期,淋巴结转移这一肿瘤进展因素,未能进一步促使其Treg表达水平增高。但外周血Treg表达却随淋巴结转移而增高,说明肿瘤还是对全身的免疫影响随疾病进展有加重的趋势。最后,我们发现Treg表达与胃癌TNM分期呈显著相关性, TNM分期越晚,外周血及淋巴结Treg表达都有明显增高趋势。说明随着胃癌的进展,以胃癌Treg为标志的患者局部和全身的免疫状况变化非常显著。因此,Treg的表达情况,一定程度上反应患者胃癌的进展情况,可以作为免疫指标进行临床应用。

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