结肠癌患者外周血内皮祖细胞数量及其功能的变化

　　作者：姜振宇,宋晓燕,马宁,姚程　　作者单位：吉林大学第一医院，吉林 长春

　　【摘要】目的 观察结肠癌患者外周血内皮祖细胞(EPC)数量及其功能的变化。方法 选择结肠癌患者32例和对照组34例，密度梯度法分离人外周血中单个核细胞，分化培养14 d后，采用RTPCR法检测内皮细胞特异性成分内皮源型一氧化氮合酶(ecNOS)，胎肝激酶1(Flk1/KDR)的表达，采用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDLDil)和FITCUEA1对细胞染色分别鉴定贴壁细胞为EPC。采用集落形成试验、改良的Boyden小室及黏附能力测定EPCs的迁移和黏附能力。结果 结肠癌患者外周血EPC数量明显增多，黏附能力，迁移能力异常增高。结论 结肠癌患者EPC数量及活力均异常增高。

　　【关键词】 结肠癌,内皮祖细胞(EPCs),血管生成

　　【Abstract】Objective To investigate changes in the number and activity of endothelial progenitor cells (EPCs) from peripheral blood in the patients with colon cancer.Methods Peripheral blood mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from colon cancer patients(n=32) and control subjects (n=34).Immunocytochemical analysis was conducted after 14 d induced differentiation，the expressions of the endothelial cellspecific components ecNOS and flk1/KDR were detected with RTPCR，the cells were stained with acLDLDil and FITCUEA1;EPC number and migration were measured by colony forming unitEPCs (CFUEPCs) assay，modified Boyden chamber assay，respectively.EPC adhesion assay was performed by replating those on fibronectincoated dishes to count adherent cells.Results The number of EPCs in colon cancer group was significantly higher than that in control subjects group.In addition，the adhesion and proliferation avtivity of EPCs with colon cancer increased respectively.Conclusions EPCs numbers and activity are abnormally increased in patients with colon cancer.

　　【Key words】Colon cancer;Endothelial progenitor cells;Angiogenesis

　　结肠癌在我国的发病率与死亡率次于胃癌、食管癌、肺癌等常见恶性肿瘤，居第4～6位，且其发病率有逐年上升趋势〔1〕。随着人们年龄的增长发病率有所增高。近年研究表明，血管内皮祖细胞(EPCs)出生后主要存在于骨髓，在某些情况下可以被动员到外周血，归巢到靶组织参与生理或(和)病理性血管形成。外周血EPCs参与肿瘤血管新生，而肿瘤新生血管系统对肿瘤发生、发展及转移起关键作用。本文拟通过观察结肠癌病人外周血EPCs的数量及迁移、黏附能力的变化，探讨其在结肠癌发病机制中的作用，为其治疗探索新的途径。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　选择2007年10月～2008年11月我院住院结肠癌病人32例，其中男18例，女14例;年龄51～73(平均59.5±12.9)岁;排除外伤、溃疡、视网膜病、近期外科手术、炎症、肿瘤等影响EPC疾病者，近3个月无急性心肌梗死发生，入选病人均未用过他汀类药物。另选取我院体检健康者34例为正常对照组，其中男19例，女15例，年龄50～75(平均60.5±13.1)岁。

　　1.2 EPCs分离、培养

　　无菌环境取患者外周静脉血，用密度梯度离心法分离单个核细胞，加入M199细胞培养液重悬细胞，计数细胞总数并进行细胞活力鉴定。将其接种于包被人纤维连接蛋白的培养皿，置于5% CO2饱和湿度培养箱中培养。3 d后换液，弃掉未贴壁细胞。此后每隔3 d更换1次培养液。

　　1.3 内皮细胞特异性成分基因水平鉴定〔2〕

　　将EPCs诱导培养14 d后，RTPCR法检测内皮细胞特异性成分内皮源型一氧化氮合酶(ecNOS)及胎肝激酶1(Flk1/KDR)的表达。

　　1.4 细胞染色与鉴定

　　EPCs与acLDLDil 37℃孵育1 h以检测EPCs对DiLDL的摄取，用2%多聚甲醛固定细胞10 min，用PBS浸洗，将FITCUEA1加于上述标本，37℃下孵育1 h。激光共聚焦显微镜鉴定acLDLDil和FITCUEA1双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。

　　1.5 EPCs计数

　　采用集落形成试验方法。分离EPCs，用人纤维连接蛋白包被6孔板，每孔置入5×106单个核细胞，孵育2 h，收集未贴壁细胞(包括EPCs)，调整密度为每孔1×106细胞，置入包被有人纤维连接蛋白的24孔板中，继续培养5 d，计数每个样本中每孔的克隆数。

　　1.6 黏附能力检测

　　用胰蛋白酶消化、收集贴壁细胞，将同等数目的EPCs接种在包被有人纤维连接蛋白的24孔培养板，培养30 min，用PBS洗去未贴壁的细胞，计数贴壁细胞。

　　1.7 迁移能力检测

　　用胰蛋白酶消化、收集贴壁细胞，将M199培养液加入改良的Boyden小室的下室，将2×104 EPCs悬浮在M199培养液后注入上室，37℃培养24 h，刮去滤膜上面未移动的细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，显微镜下随机选择3个视野，计数迁移到底层的细胞数。

　　1.8 统计学处理

　　计量资料用x±s表示，采用SPSS13.0进行组间资料的方差分析。

　　2 结果

　　2.1 内皮细胞特异性成分基因水平鉴定

　　ecNOS在548 bp处出现条带，Flk1在819 bp处出现条带，GADPH为内参。

　　2.2 细胞染色与鉴定

　　UEAI染色呈红色荧光，DiLDL染色呈绿色荧光，UEAI和DiLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。

　　2.3 各组EPCs数量及黏附、迁移能力的比较

　　结肠癌组EPCs数量、黏附和迁移能力均显著高于正常对照组(P<0.05)。

　　3 讨论

　　血管EPCs是血管内皮的前体细胞，亦称为成血管细胞(angioblast)，是一类具有游走、增殖并能分化为血管内胞，但缺乏成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞〔3〕。1997年，Asahara等人首次分离并证实成年人外周血中存在着能分化为血管内皮细胞EPCs，并在体内证实了其生成血管的能力〔4〕。它不仅在胚胎期参与血管生成，而且在出生后也参与血管新生过程〔5〕。提示 EPCs在肿瘤、缺血性疾病、创伤愈合等中的重要治疗作用和广阔的临床运用前景。

　　本文结果表明，结肠癌患者EPCs的数量及活力均异常增高。肿瘤拥有丰富的血管供应，EPCs参与肿瘤的血管发生，促进肿瘤生长已经得到了证实。Muta等人〔6〕的研究表明，EPCs可以特异性蓄积在肿瘤部位。一些细胞生长因子作为介导EPCs从骨髓释放到循环血的信号， 例如血管内皮生长因子(VEGF)和粒巨噬集落刺激因子 (GMCSF)。VEGF除了直接促进 EPCs的动员，还能促进其他生长因子如GMCSF的释放。其他生长因子，包括血管生成素1、成纤维细胞生长因子和基质细胞源性生长因子1(SDF1)也可促进 EPCs的动员和募集〔7〕。

　　EPCs的研究尚处于起步阶段，目前大多数研究仅停留于动物实验阶段，若将EPCs应用于临床仍有许多问题需要解决。有关其确切的惟一的表面标记还没有定论，有很多因素对EPCs有影响，如何正确应用以避免短期或长期的副作用也尚需深入探讨。所以，还要对EPCs的生物学特性和临床应用进行更多的研究。

　　【参考文献】

　　1 卢震海,万德森,王国强,等.1126例结肠癌患者的临床病理特征及预后分析〔J〕.广东医学，2007;28(9)：90810.

　　2 姜振宇,宋晓燕,林 海,等.人低氧诱导因子1α转染人骨髓内皮祖细胞的体外实验〔J〕.吉林大学学报(医学版),2008;34(6):9448.

　　3 Caprioli A，Jaffredo T，Gautier R,et al.Bloodborne seeding by hematopoietic and endothelial precursors from the allantois〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1998;95：16416.

　　4 Asahara T，Murohara T，Alison S,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells of angiogenesis〔J〕.Science，1997;275(5302):9647.

　　5 Isner JM，Asahara T.Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization〔J〕.J Clin Invest，1999;103(9):1231.

　　6 Muta M，Matsumoto G，Hiruma K,et al.Impact of vasculogenesis on solid tumor growth in a ratmodel〔J〕.Oncol Rep，2003;10(5)：12138.

　　7 Ceradini DJ，Kulkarni AR，Callaghan MJ,et al.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF1 induction of SDF1〔J〕. Nat Med，2004;10 (8)：85864.