金莲花黄酮对人乳腺癌细胞作用的研究

　　作者：孙黎,刘芳,刘华,罗强,安芳　　作者单位：河北北方学院实验中心，河北 张家口

　　【摘要】目的 探讨金莲花黄酮对人乳腺癌MCF7细胞株细胞增殖抑制作用及对端粒酶活性的影响。方法 不同浓度金莲花黄酮作用于MCF7细胞24 h，以CCK8法检测细胞增殖抑制作用、流式细胞术检测端粒酶活性。结果 9.516、6.344、3.172、1.586、0.793 mg/ml 5个不同浓度金莲花黄酮作用于MCF7细胞24 h，对细胞增值的抑制率依次为17%、28%、48%、50%、55%。各实验组A490与对照组比较差异均显著(P<0.05，P<0.01)，且用药浓度与抑制率呈正相关;端粒酶活性均有不同程度降低、且端粒酶活性与用药浓度成正比。结论 金莲花黄酮对MCF7细胞有明显抑制作用并降低端粒酶活性。

　　【关键词】 金莲花黄酮,MCF7,CCK8,端粒酶活性

　　【Abstract】 Objective To investigate the inhibition effects and telomerase activity of Trollius flavonoids on human breast cancer cell line MCF7. Methods MCF7 cells were treated by Trollius flavonoids of different concentrations for 24 h. The inhibition effect of cell proliferation was detected by CCK8 method, and the telomerase activity was detected by flow cytometry. Results The inhibition rates of MCF7 cell proliferation were 17%, 28%, 48%, 50%, 55% after treatment with different concentrations of flavonoids Trollius (9.516, 6.344, 3.172, 1.586, 0.793 mg /ml, respectively) for 24 h, and there was significant difference between experimental and control groups. There was positive correlation between drug concentration and inhibition rate. The telomerase activity was reduced in some degree, and was directly proportional to the concentration of the drug. Conclusions Trollius flavonoids has significant inhibition effect on MCF7 cells and reduces the telomerase activity.

　　【Key words】 Trollius flavonoids; MCF7; CCK8; Telomerase activity

　　欧美国家新诊断的乳腺癌中≥65岁的病人约占一半〔1〕。在美国等西方国家及中国一些大中城市,乳腺癌已占居妇女恶性肿瘤死亡的首位〔2〕。近期研究表明金莲花具有抗病毒、抗氧化活性〔3，4〕，黄酮类化合物还有抗癌、降压和解痉作用〔5〕，临床上用于治疗慢性支气管炎、泌尿系感染、急性呼吸道感染等〔6～8〕，具有良好功效。但对金莲花黄铜的抗肿瘤研究还未见报道。本研究主要探讨金莲花黄酮对人乳腺癌MCF7细胞增殖及对端粒酶活性的影响，从分子生物学水平揭示其作用机制，为金莲花黄酮进一步研究开发及临床治疗提供新的依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂和仪器 MCF7细胞株由北京肿瘤研究所遗传室提供，本院实验中心细胞室传代、冻存;CCK8为上海同仁化学产品;DMEM培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清购自天津市川页生化制品有限公司,兔抗人端粒酶(Telomerase，TERT)单克隆抗体及荧光标记山羊抗兔IgG(FITC)均为美国BD公司产品。其他试剂是国产分析纯。美国 Stat Fax2100酶标仪,美国 FACSA ria流式细胞仪。

　　1.2 金莲花黄酮的制备 称取5.0 g经清洗、烘干、去梗后粉碎的金莲花，置于250 ml圆底烧瓶中，按正交表，加入相应的溶剂，充分振荡，浸泡1 h后于恒温水箱中回流提取(每隔10 min振荡1次)，过滤。再按同法二次提取，合并滤液，减压浓缩，定容至25 ml,8磅15 min高压灭菌4℃保存。

　　1.3 MCF7细胞培养 于DMEM培养液中加入10%胎牛血清及100 U/ml庆大霉素，用7.6% NaHCO2调至pH 7.4，加入复苏的MCF7细胞，置37 ℃、5% CO2培养箱进行培养。每2～3 d换1次培养液。当细胞生长至对数生长期加入不同浓度金莲花黄酮处理。

　　1.4 CCK8法检测金莲花黄酮对肿瘤细胞的抑制作用 取对数生长期密度为2×105/ml 的MCF7细胞，接种于96孔培养板上，100 μl/孔。 用DMEM培养液将金莲花黄酮稀释成9.516、6.344、3.172、1.586、0.793 mg/ml 5个不同浓度，并分别加入96孔培养板(100 μl/孔)，每组设4个复孔，对照组加入等体积培养液，培养24 h。实验终止前4 h每孔加入CCK8 20 μl，10 min后以酶标仪检测吸光度(A490值)，按公式计算MCF7细胞抑制率。抑制率(%)=(1-实验组平均A490值/对照组平均A490值)×100%。

　　1.5 不同浓度金莲花黄酮对MCF7细胞TERT定量表达的测定 取对数生长期MCF7细胞(密度为1×106/ml)分别接种于25只50 ml的培养瓶，1.5 ml/瓶，实验组分别加入6.344，3.172，1.586 mg/ml浓度的金莲花黄酮1.5 ml，对照组加入1.5 ml培养液，空白组加入1.5 ml PBS(pH 7.4)，每个浓度设5个复孔。培养24 h后,用4℃缓冲液离心1 500 r/min、7 min洗2次(去上清),用4%多聚甲醛1 ml悬起细胞,室温孵育10 min。同法用4℃缓冲液洗1次(去上清),加甲醇1 ml悬起细胞,室温孵育10 min。同法用4℃缓冲液洗1次(去上清),用0.2%TristonX100液1 ml悬起细胞,选用一抗稀释液100 μl混匀室温避光孵育30 min,4℃缓冲液洗1次(去上清)。选用荧光标记二抗稀释液100 μl悬起细胞,室温避光孵育30 min,用4℃缓冲液离心洗1次(去上清),用PBS缓冲液配制0.1%多聚甲醛250 μl悬起细胞,4℃冰箱保存24 h,上机测试。实验组加兔抗人TERT抗体和山羊抗兔IgG(FITC)各100 μl及不同浓度的浓度金莲花黄酮,空白组加等量的PBS(pH 7.4)代替一抗和二抗,对照组不加药物加一抗和二抗。人乳腺癌细胞MCF7加金莲花黄酮后流式细胞仪定量检测荧光素标记山羊抗兔IgG与兔抗人TERT抗体结合TERT蛋白表达。

　　1.6 统计学处理 应用SPSS12.0软件行t检验。

　　2 结果

　　2.1 金莲花黄酮对MCF7细胞增殖的抑制作用 9.516、6.344、3.172、1.586、0.793 mg/ml 5个不同浓度的金莲花黄酮对 MCF7细胞的生长的抑制作用随着浓度的增加而增加，分别为17%、28%、48%、50%及55%。各实验组A490与对照组比较，差异均显著(P<0.05，P<0.01)。

　　2.2 金莲花黄酮对MCF7细胞TERT表达的影响(%) 6.344，3.172，1.586 mg /ml 3个不同浓度的金莲花黄酮作用MCF7细胞24 h，得出TERT量的均数依为7.314±2.237，10.476±1.917，15.504±4.739，均较对照组(35.340±5.744)显著减少(P<0.01)，且金莲花黄酮对人乳腺癌细胞MCF7 TERT的作用呈剂量依赖性。

　　3 讨论

　　现代医学研究表明，肿瘤是细胞增殖、分化和细胞凋亡异常引起的以细胞失控性生长和增殖为主要特征的疾病。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，自己结束其生命的过程，具有严格的基因失控性和选择性〔9〕。乳腺癌的发生发展同其他肿瘤性疾病一样，不仅与细胞的异常增殖和分化有关，也与细胞凋亡的异常有关。

　　真核细胞染色体末端含有串联重复的DNA序列称为端粒,TERT是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶,含有引物特性和识别位点,能以自身的RNA组分为模板合成DNA的TTAGGG重复序列,并加到染色体的末端以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短。对肿瘤的研究发现,大多数癌细胞系和肿瘤细胞中端粒酶均有高水平表达,表明端粒酶的激活表达与细胞的无限增殖有密切关系〔6，10〕。那么控制TERT的激活,减少肿瘤细胞中TERT的数目,使其不再有保护端粒长度稳定不变的功能,从而达到抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的目的,可能会成为新的肿瘤治疗方向。

　　本研究结果表明，金莲花黄酮在体外对乳腺癌细胞具有抗肿瘤活性。流式细胞术检测TERT活性结果显示，TERT量的均数依所加入金莲花黄酮量的逐次减少而增加。可以进一步证实金莲花黄酮抑制人乳腺癌细胞MCF7 TERT的活性,具有明显的抗肿瘤作用,为今后金莲花黄酮用于肿瘤的治疗提供了理论依据。

　　【参考文献】

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　　7 Lauzon W,Dardon JS,Cameron DW,et al.Flow cytometric measurement of telomere length〔J〕.Cytometry,2000;42(3):15964.

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　　10 Myung SJ,Kim MH,Kim YS,et al.Telomerase activity in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer may be complementary to Kras mutation〔J〕.Gastrointest Endosc,2000;51(6)：70813.