乳腺癌外周血CK-19 mRNA的表达及临床意义

　　作者：李海涛　刘迎欣,裴元民　　作者单位：山东省潍坊市益都中心医院　普外科　(山东　青州　262500)

　　【摘要】目的：研究外周血CK-19 mRNA表达与乳腺癌临床生物学指标的关系，探讨其作为乳腺癌微转移标志物的可能性，并判断手术和化疗对血液微转移的影响。方法：应用RT-PCR技术检测50例乳腺癌患者(乳腺癌组)术前、术后第2天、第1次化疗结束后以及术后9~12个月外周血中CK-19 mRNA的表达情况，并以20例乳腺良性疾病(良性对照组)和20例正常健康女性(正常对照组)作为对照。结果：术前乳腺癌组外周血CK-19 mRNA 阳性率为24.00%(12/50)，其中0~I期15.38%(2/13)，II期20%(6/30)，III期57.14%(4/7)，III期乳腺癌CK-19 mRNA 阳性表达率明显高于0~I、II期(P<0.05);有淋巴结转移者42.11%(8/19)表达阳性，无淋巴结转移者12.94%(4/31)表达阳性，二者差异有统计学意义(P<0.05) 。良性疾病组CK-19 mRNA的阳性率为5.00%(1/20)，正常对照组均阴性，乳腺癌组与良性疾病组和正常对照组比较差异有统计学意义( P均<0.01)。 乳腺癌组术后第2天CK-19 mRNA 阳性率为26%(13/50)，与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后首次化疗结束后CK-19 mRNA 阳性率为12%(6/50)，化疗前后差异有统计学意义(P<0.01)。综合治疗9~12个月后CK-19 mRNA阳性率为10%(5/50)，与术前比较差异有统计学意义(P<0.01)。外周血CK-19 mRNA阳性率与雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、CerbB2、p53状态无关。结论：CK-19 mRNA可作为检测乳腺癌患者外周血微转移的分子学标志物，有助于早期预测乳腺癌发生血道微转移，对指导治疗和评估预后具有重要意义。

　　【关键词】 乳腺肿瘤,CK-19 mRNA,外周血,微转移

　　【ABSTRACT】 Objective: To study the relationship between expression of CK-19 mRNA in peripheral blood and biological characteristics of breast cancer， and evaluate its clinical significance, to explore the effects of operation and postoperative chemotherapy on micro metastasis in breast can　　乳腺癌是一种全身性疾病，在疾病早期肿瘤细胞就可能经血液播散出现远处转移[1]。如果能在发生转移的早期及时诊断出“微转移”并加以有效控制，对提高乳腺癌的治愈率和存活率都具有非常重要的临床价值。本研究通过实时定量PCR方法检测乳腺癌患者术前、术后、化疗1次及综合治疗9~12个月后外周血细胞角蛋白(cytokeratin，CK)-19 mRNA的表达，并检测原发肿瘤中孕激素受体(progesterone receptor，PR)、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、CerbB2、p53的表达，同时对每例乳腺癌手术标本的腋淋巴结进行连续切片检查，确定有无淋巴结转移，研究外周血CK-19 mRNA与乳腺癌生物学特性的关系，并探讨其临床意义。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料

　　我院2006年8月—2007年2月行乳腺癌手术50例，共50侧，均为女性;年龄35~78岁，平均年龄49.2岁。左侧24例，右侧26例，按照第6版AJCC乳腺癌TNM分期，0~I期13例，II期30例，Ⅲ期7例。将此50例患者作为乳腺癌组，以同期我院20例良性乳腺疾病患者和20例正常健康女性为良性对照组和正常对照组，所有入组者术前均未接受任何特殊治疗。

　　1.2　标本采集时机

　　1)术前;2)术后第2天;3)术后化疗第1个疗程结束后当天;4)综合治疗9~12个月。取血部位为对侧上肢浅静脉，取血时为防止表皮细胞干扰，第1管1 mL均弃用，换注射器后再抽取5 mL血。

　　1.3　化疗方案

　　术后化疗均在术后7~10 d开始进行，方案为CEF：环磷酰胺(CTX) 600 mg/m2，表柔比星(EPI)70 mg/m2，5-氟尿嘧啶(5-FU)500 mg/m2，静滴，共1 d;0期患者1例未行化疗。

　　1.4　CK-19 mRNA检测

　　取每位患者的原发肿瘤组织用PR试剂盒按说明书步骤用两步法检测肿瘤的ER、PR、C-erbB2、p53。同时对每位乳腺癌根治手术标本的腋淋巴结进行连续切片检查确定有无淋巴结转移。

　　1.5　统计学处理

　　应用SPSS10.0统计软件包进行分析，对所有数据进行χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　外周血CK-19 mRNA的检测

　　术前乳腺癌患者外周血CK-19 mRNA 阳性率为24.00%(12/50)，其中0~Ⅰ期表达阳性15.38%(2/13)，Ⅱ期20.00%(6/30)，Ⅲ期57.14%(4/7)，Ⅲ期乳腺癌CK-19 mRNA 阳性表达率明显高于0~Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05);有淋巴结转移者表达阳性占42.11%(8/19)，无淋巴结转移者占12.90%(4/31)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。良性对照组CK-19 mRNA的阳性率为5.00%(1/20)，正常对照组均阴性，与乳腺癌组比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。乳腺癌组术后第2天CK-19 mRNA的阳性率为26.00%(13/50)，与手术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后首次化疗结束后CK-19 mRNA 阳性率为12.00%(6/50)，化疗前后阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。综合治疗9~12个月后CK-19 mRNA阳性率为10.00%(5/50)，与术前比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2　外周血CK-19 mRNA表达与临床病理因素的关系

　　外周血CK-19 mRNA表达阳性率与ER、PR、CerbB2、p53状态无关。

　　3　讨论

　　微转移是指常规检查方法不能发现的恶性肿瘤转移灶，包括直径<2 mm的微小转移及肿瘤原发灶以外组织或循环中的单个肿瘤细胞。对微转移的大小标准尚存在争论，多数学者以直径<2 mm作为微转移的判断标准[2]。肿瘤发生微转移时脱落的癌细胞数量少且浓度低，以往的免疫组织化学、形态学等方法无法检测出存在于血液、骨髓、淋巴结等处的微转移。随着分子生物学技术的发展，IHC、RT-PCR及流式细胞术在微转移检测中得到广泛应用[3]。RT-PCR检测微转移是目前敏感性最高的方法之一，可检测出106~107个细胞中的1个肿瘤细胞，其敏感性分别是IHC和流式细胞术的10倍和100倍以上。应用RT-PCR检测微转移的前提是存在能够证实癌存在的标志物。

　　CK是一类细胞结构蛋白的总称， CK-19是上皮细胞骨架的组成成分，也是上皮来源恶性肿瘤细胞中间丝的组成成分，是上皮组织特有的成分，在其他组织中如内皮细胞、淋巴细胞、纤维细胞等不存在。乳腺癌细胞属于上皮来源的恶性肿瘤，因此，在原发性乳腺癌的患者中，如果在外周血中检测到CK-19 mRNA，则考虑发生血道微转移的可能。 CK19在正常的外周血、骨髓及淋巴结中无表达，具有高度组织特异性，在乳腺癌细胞中广泛表达，是检测乳腺癌微转移最有价值的标志物[4-5]。

　　3.1　检测外周血CK-19的临床意义

　　通过检测外周血CK-19来判断外周血里是否有上皮细胞或上皮细胞的成分，以判断是否有上皮来源的乳腺肿瘤细胞存在。本研究中，乳腺癌组与良性对照组及正常对照组阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01)，但也发现良性疾病组CK-19 mRNA假阳性率达5.00%。有研究报道，造成假阳性表达的原因可能有上皮细胞的污染、假基因的干扰、外周血中CK-19 mRNA的低水平表达等[6]。

　　3.2　根治性手术对血液微转移的影响

　　手术刺激可导致恶性肿瘤细胞转移，但规范的手术操作并不会引起术中肿瘤的刺激和转移，本研究也说明了这一点，术后CK-19 mRNA阳性患者比术前多1例，但二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。另外，通过本研究发现术后CK-19 mRNA阳性患者并没有比手术前少，说明这些CK-19 mRNA阳性是外周血中微转移的表达，并不是原发灶的表达，因而不会因为原发灶切除而出现CK-19转为阴性，这是此实验可靠性的又一有力证明。

　　3.3　术后化疗对血液微转移的影响

　　本研究通过对进行化疗的49个病例(另1例T0期患者仅行单纯乳腺切除，术后未进行化疗)进行随访复查发现，化疗前后外周血CK-19 mRNA的阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。说明化疗可以杀灭残留在外周血中的肿瘤细胞，使外周血中微转移消失。另一方面也说明并不是每个患者对化疗都有效果，本研究经过随访发现术后9～12个月，经过综合治疗后仍有41.67%(5/12)的患者外周血CK-19 mRNA为阳性，说明患者对化疗可能不敏感。而这5例患者中已经有1例出现了远处转移，1例出现了对侧乳腺转移，其余3例患者尚没有出现复发或者转移的证据，还需经过更长期的随访。本研究显示，对乳腺癌患者进行外周血CK-19 mRNA的检测随访可以作为化疗评价的一个指标，对乳腺癌患者化疗前后CK-19的表达变化进行比较来评价化疗是否有效。

　　综上所述，乳腺癌微转移的检测不仅可以正确划分肿瘤的临床分期、判断预后，而且对于术后综合治疗的选择也有显著意义。对于存在微转移的乳腺癌患者可选择辅助性治疗(化疗、内分泌治疗、局部放疗等)，降低术后复发率，同时也使无微转移的患者免于因全身治疗或局部放疗而带来的不良反应。随着分子生物学技术的发展和应用，特别是PCR技术的发展和成熟使得乳腺癌患者的外周血检测微转移成为可能;同时期待新的更敏感和特异的乳腺癌相关肿瘤标志物的出现，将可能对诊断乳腺癌早期转移、指导临床和判断预后提供新的依据,指导医生制定具有预见性的治疗方案，控制复发转移病灶，改善患者的生活质量，提高目前乳腺癌治疗的总体水平，使乳腺癌的治疗更加符合医学美学、社会心理学和生物学模式。

　　【参考文献】

　　[1] Grunewald K, Haun M, Urbanek M, et al. Mammaglobin gene expression: a superior marker of breast cancer cells in peripheral blood in comparison to epidermal-growth-factor receptor and cytokeratin-19[J]. Lab Invest, 2000,80(7):1071-1077.

　　[2] Liang WC, Sickle-Santanello BJ, Nims TA, et al. Is a completion axillary dissection indicated for micrometastases in the sentinel lymph node[J]. Am J Surg, 2001,182(4):365-368.

　　[3] Ishida M, Kitamura K, Kinoshita J, et al. Detection of micrometastasis in the sentinel lymph nodes in breast cancer[J]. Surgery, 2002,131(1 Suppl):s211-216.

　　[4] Schoenfeld A, Kruger KH, CommJ, et al. The detection of micrometastasis in the peripheral blood and bone marrow of patients with breast cancer using immunohistochemistry and reverse transcriptase polymerase chain reaction for keratin 19[J]. Eur J Cancer, 1997,33(6):854-861.

　　[5] Zhang J, Shen KW, Liu G, et al. Antigenic profiles of disseminated breast tumor cells and microenvironment in bone marrow[J]. Eur J Surg Oncol, 2003,29(2):121-126.

　　[6] Ko Y, Grunewald E, Totzke G, et al. High percentage of false–positive results of cytokeratin 19 RT-PCR in blood :a model for the analysis of illegitimate gene expression[J]. Oncology, 2000,59(1):81-88.