人参二醇皂苷对重症胰腺炎急性肺损伤时水通道蛋白表达的影响

　　作者：赵航 陈光 王贵民 孙东辉 张永喜 赵雪俭 谭毓铨 作者单位：(吉林大学第一医院普外科，吉林 长春 130021)

　　【摘要】 目的 探讨人参二醇皂苷(panaxadiols，PDS)对急性重症胰腺炎(SAP)急性肺损伤时的水通道蛋白(AQP1)影响。方法 Wistar大鼠随机分为假手术组(SO组)、SAP组、地塞米松组(DEX组)和PDS组，每组8只。SAP组、DEX组和PDS组大鼠胰管逆行注射5%牛磺酸黄制备大鼠胰腺炎模型;SO组手术操作同其他组，但不向胰管内注射5%牛磺酸钠。制模成功后DEX组腹腔注入DEX，剂量为0.5 mg/100 g;PDS组腹腔注入PDS，剂量为2.5 mg/100 g。模型制作6 h后杀鼠，测定血清淀粉酶、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)，肺脏湿/干重比值;应用RTPCR测定肺脏AQP1 mRNA的水平，应用蛋白印记杂交方法观察AQP1蛋白改变情况。结果 应用PDS治疗后AQP1在mRNA和蛋白水平均有所增加，减轻了肺水肿、肺损伤。结论 在SAP时应用PDS可以抑制TNFα、IL6表达，减轻血液浓缩，改善微循环，增加肺组织水通道蛋白1的表达，从而减轻肺水肿、肺损伤。

　　【关键词】 水通道蛋白;急性重症胰腺炎;急性肺损伤

　　急性重症胰腺炎常合并肺水肿、肺损伤，肺脏水通道蛋白(aquaporin1，AQP1)表达减少，在 mRNA水平和蛋白表达水平均有明显下降，说明AQP1表达的减少在急性胰腺炎肺水肿发生中起了重要作用〔1〕，地塞米松通过抑制炎症反应介质、提高水通道蛋白表达等改善SAP肺损伤〔2〕。PDS对应激状态下的细胞膜及细胞器有较强的保护作用，促进细胞DNA的合成和损伤后的修复，促进细胞有丝分裂加快增殖和生长速度，抑制细胞凋亡。人参皂苷具有抗休克、保护细胞膜、增加清除氧自由基的功能，在休克、缺血等方面的实验中发现其具有和糖皮质激素相同的作用，达到保护细胞，细胞器的功能，促进LPS休克大鼠肺组织AQP1表达。本实验旨在探讨在胰腺炎治疗中应用PDS的效果。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 Wistar 大鼠，体重200～250 g，雄雌不限，购自吉林大学实验动物中心;牛磺胆酸钠购自Sigma公司。RNAoutTM购自华氏生物公司;TNFα、IL6放免检测试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。抗大鼠AQP1抗体由美国加州大学旧金山医学院杨宝学教授惠赠，PDS由吉林大学基础医学院天然药物研究室提供。

　　1.2 模型制备 大鼠适应性饲养1 w。术前12 h禁食、不禁水。随机分为SAP组、假手术(SO)组、地塞米松(DEX)组和PDS组，每组8只。SAP组乙醚浅麻醉后，上腹部正中切口长约1 cm入腹;找到十二指肠侧壁胰胆管汇合膨大处，用四号针头(平面朝上)穿刺，成功后向胆总管内进入约5～6 mm，用无创小血管夹于肝门侧暂时阻闭肝门侧胆管;向胆胰管内逆行匀速注入5%牛磺胆酸钠(剂量为0.1 ml·100 g-1·min-1);10 min后去除动脉夹，关腹。SO组手术操作方法同SAP组，但不向胰管内注入牛磺胆酸钠。DEX组在制模成功后，腹腔内注入DEX，剂量为0.5 mg/100 g。PDS组在制模成功后，腹腔内注入PDS，剂量为2.5 mg/100 g。各组动物于手术结束后皮下注射0.9%氯化钠2 ml，以补充丢失的水分。于造模6 h后杀鼠。经下腔静脉采取5 ml血，离心(3 000 r/min，3 min)，取上清，-20℃冻存。取左肺测定肺湿重/干重比，右肺取出一部分立即10%甲醛固定，行组织学观察。其余部分立即冻存于液氮中，-80℃冰箱中保存。

　　1.3 血清淀粉酶、白蛋白、红细胞压积、TNFα、IL6测定 应用自动生化分析仪测定血清中淀粉酶(AMS)和血清白蛋白，红细胞压积采用流式细胞仪检测，应用TNFα、IL6放免检测试剂盒采用放免法检测血清TNFα、IL6水平。

　　1.4 肺湿/干重比值测定、组织学观察 杀鼠后取左叶肺组织测定湿重，90℃烘烤48 h后，测定干重，测定湿/干重比值。固定后的肺组织常规切片、HE染色后镜下观察。

　　1.5 肺组织AQP1mRNA表达 采用RNAoutTM按照操作说明提取肺组织总RNA，并检测纯度及完整性。在100 μl 逆转反应体系中加入5 μg大鼠肺组织 RNA，逆转录合成及纯化cDNA。行RTPCR：AQP1引物序列：5′ATGGCCAG CGAGTTAAAGAAGA3′，反向引物：5′TTTGGGCTT CATCTCCACCCTG3′。 扩增的条件：94℃变性3 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s,65℃延伸1 min,30循环;最后72℃延伸5 min。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。凝胶成像仪记录、分析。

　　1.6 肺组织AQP1蛋白表达 取肺组织100 mg,加入0.9 ml蛋白提取液，4℃下反复离心提取膜蛋白。测定膜蛋白浓度。取蛋白质15 μg，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用电转仪将蛋白转移到硝酸纤维素(PVDF)膜上，然后行免疫印迹：将兔抗鼠AQP1抗体1∶500稀释溶于TBST，室温孵育60 min，加入1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG二抗。室温孵育60 min。加入NBTBCIP显色液显色，Stop Buffer终止染色。特异性条带的光密度值采用GIS图像分析系统处理。

　　1.7 统计学方法 各组数据用x±s表示，应用EXCEL工作表t检验进行统计处理。

　　2 结果

　　2.1 血清淀粉酶、TNFα、IL6、红细胞压积、肺湿/干重比值测定和组织学观察 重症胰腺炎模型制作6 h后血清炎症介质TNFα、IL6均有显著升高。PDS组、DEX治疗组血清中炎症介质TNFα和IL6减少，肺组织中含水量减少，肺水肿减轻，血液浓缩情况有所改善。见表1。镜下观察到SAP组大鼠肺组织细胞腔扩大、肺泡壁断裂，有的出现肺大泡，肺泡内伴有渗出及少量肺出血，肺组织可见炎细胞浸润。应用DEX、PDS后肺组织水肿及组织炎细胞浸润减轻。

　　2.2 AQP1mRNA在肺组织中的表达 急性重症胰腺炎肺损伤模型制作6 h后，肺组织内水通道蛋白AQP1 mRNA表达有所减少。应用PDS、地塞米松后表达有所增加。见图1。

　　表1 不同实验组大鼠血清淀粉酶、肺湿/干重比值、血清TNFα、IL6、白蛋白、红细胞压积对比(略)

　　与SO组比较：P<0.05，2)P<0.01;与SAP组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

　　2.3 AQP1蛋白在肺组织中的表达 重症胰腺炎肺损伤模型制作成功后6 h后，水通道蛋白1表达有所减少，与AQP1mRNA表达相一致。应用地塞米松、PDS后AQP1表达有所增加。见图2。

　　图1 AQP1mRNA在肺组织中的表达(RTPCR)(略)

　　图2 AQP1蛋白在肺组织中的表达(蛋白印记杂交)(略)

　　3 讨论

　　ARDS是重症胰腺炎常见而严重的并发症之一，血清炎症介质IL6、TNFα释放增加，参与SAP后急性肺脏损伤，加之SAP后血清白蛋白减少，加重肺水肿形成，大量液体渗出到第三间隙后造成血液浓缩(红细胞压积升高)，进一步造成组织循环障碍、缺血缺氧，加重肺脏功能损害。研究发现，肺脏水通道蛋白AQP1表达减少，在 mRNA水平和蛋白表达水平均有明显下降，说明水通道蛋白AQP1表达的减少在急性胰腺炎肺水肿发生中起了重要作用。应用DEX可以抑制炎症介质的释放、抑制NFκB的表达及核迁移，在mRNA和蛋白水平上增加了AQP1的表达，减轻了重症胰腺炎所致的肺水肿、肺损伤，说明水蛋白表达的减少参与SAP急性肺损伤的发生〔1，2〕。可能与AQP1启动子中糖皮质激素反应元件相关〔3，4〕。

　　PDS对应激状态下的细胞膜及细胞器有较强的保护作用。促进细胞DNA的合成和损伤后的修复，促进细胞有丝分裂加快增殖和生长速度，抑制细胞凋亡。人参皂苷具有抗休克、保护细胞膜、增加清除氧自由基的功能。在休克、缺血等方面的实验中发现其具有和糖皮质激素相同的作用，达到保护细胞，细胞器的功能，促进LPS休克大鼠肺组织AQP1表达〔5〕。本研究中应用人参二醇皂苷减少炎症介质IL6、TNF释放，通过减轻红细胞浓缩、减轻组织器官水肿、改善微循环，增加肺组织水通道蛋白表达，减轻肺水肿及肺损伤。人参二醇皂苷没有糖皮质激素免疫抑制等副作用，具有在临床治疗中替代糖皮质激素的潜能。在重症胰腺炎肺损伤治疗中应用PDS可以抑制炎症反应，促进水通道蛋白表达，达到减轻肺水肿、肺损伤的作用。

　　【参考文献】

　　1 王贵民，王银萍，赵雪俭，等.AQP1蛋白在重症胰腺炎急性肺损伤中的表达〔J〕.中华普通外科杂志，2006;21(4)：3012.

　　2 王贵民，所 剑，王忠义，等.地塞米松对重症胰腺炎急性肺损伤时水通道蛋白表达的影响〔J〕.中华普通外科杂志，2007;22(2)：1578.

　　3 King LS，Nielsen S，Agre P.Aquaporin1 water channel protein in lung：ontogeny，steroidinduced expression，and distribution in rat〔J〕.J Clin Invest，1996;97:218391.

　　4 King LS，Agre P，Pathophysiology of the aquaporin water channels〔J〕. Annu Rev Physiol，1996;58:61948.

　　5 刘喜春,李 璐，于振香，等.人参二醇皂苷对LPS休克大鼠肺组织AQP1表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2006;22(8)：15625.