基质金属蛋白酶及抑制因子与腹主动脉瘤临床病理特点的相关性研究

　　作者：赵志强　卢明书　张鹏　张启文　王豪夫 作者单位：1莱芜市人民医院　普通外科　(山东　莱芜　271100)2青岛大学医学院附属医院　肝胆血管外科　(山东　青岛　266003)

　　【摘要】目的：研究基质金属酶(MMP)-2、MMP-9及抑制因子TIMP-1在腹主动脉瘤中的表达及与临床病理特征之间的关系。方法：应用免疫组化PV-9000通用型二步法对70例腹主动脉瘤和15例正常腹主动脉标本中的MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达进行检测。结果：腹主动脉瘤组织中MMP-2和MMP-9蛋白表达阳性率明显高于正常腹主动脉组织，TIMP-1蛋白表达阳性率和正常腹主动脉没有统计学差异，(χ2=0.103，P=0.991); MMP-2蛋白的表达与腹主动脉瘤的直径呈负相关(χ2=13.785，P=0.032)， MMP-9蛋白的表达与患者临床症状，腹主动脉瘤直径、破裂有相关性，(P<0.05)， TIMP-1蛋白表达阳性率与临床病理特征无相关性(χ2=0.103，P=0.991)。结论：腹主动脉瘤组织中MMP高表达和TIMP的相对弱表达在腹主动脉瘤发生、发展过程中起重要作用， MMP-9可以预测腹主动脉瘤的自然病程从而作为腹主动脉瘤手术治疗的指征之一。

　　【关键词】 基质金属蛋白酶　基质金属蛋白酶抑制因子　腹主动脉瘤　临床病理特点

　　The study of relationship between matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase and the clinical pathology of human abdominal aortic aneurysm

　　ZHAO Zhi-qiang1, LU Ming-shu1, ZHANG Qi-wen1 , ZHANG Peng1, WANG Hao-fu2

　　1 Department of General Surgery, Laiwu People’s Hospital ( Shandong 271100, China)

　　2 Department of Hepatobiliary and Vascular Surgery, the Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University (Qingdao 266003, China)

　　【ABSTRACT】 Objectives: To explore the expression of matrix metalloproteinase MMP-2, MMP-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase TIMP-1 in human abdominal aortic aneurysm (AAA). Methods: The MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 were measured by the immunohistochemical two-step methods of PV-9000 in seventy specimens of AAAs and 15 normal abdominal aorta tissues. Results: The positive rate of MMP-2 and MMP-9 in AAA were significant highly than those in normal abdominal aorta tissues. The expression of MMP-2 and the diameter of AAA had significant negative-correlation. The expression of MMP-9 had significant correlation with the diameter of AAA, rupture and symptom. Significant difference was not found between the positive rate of TIMP-1 in AAA and normal abdominal aorta. The expression of TIMP-1 had no correlation with clinical pathological features of AAA. Conclusion: The study suggests the principal metalloproteinase in small aneurysms was MMP-2 and MMP-9 was involved in aneurysms expansion at a later stage.

　　【KEY WORDS】 Matrix metalloproteinase·Tissue inhibitor of metalloproteinase·Abdominal aortic aneurysm·clinical pathology

　　2002年6月~2005年3月，我们应用免疫组化方法检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase ，MMP)-2、MMP-9和 抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase ，TIMP)-1在腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)和正常腹主动脉组织中的表达，探讨不同MMP在AAA不同发病阶段的不同作用及与AAA临床病理特征之间的关系。从而为探索AAA的病因学治疗, 控制AAA生长,预防其破裂奠定基础。

　　1　资料与方法

　　1.1　临床资料　本组的AAA手术标本70例，均为青岛大学医学院附属医院肝胆血管外科1992~2005年中手术切除存档石蜡标本，择期手术AAA切除55例(非破裂组)，破裂型AAA急症手术切除15例(破裂组)。70例患者中，男52例，女18例，年龄 48~84岁，中位年龄70.7岁。术中均可见腹主动脉呈梭状扩张及瘤壁内膜显著的动脉硬化改变。术后病理诊断均为AAA;所有病例均有完整的临床资料和随访资料。15例正常腹主动脉壁标本取自非正常死亡的健康成人尸体，经大体观察和镜下病理检查证实为正常腹主动脉组织。标本于死亡后立即采集。所有标本均用4%多聚甲醛固定，脱水,石蜡包埋,3μm 连续切片备用。

　　1.2　检测方法　一抗及PV9000试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用免疫组化PV9000试剂盒检测筛选标本中MMP-2 ,MMP-9 ,TIMP-1蛋白。严格按照试剂盒说明书进行操作。 另用已知MMP-2 和MMP-9阳性的乳腺癌组织作阳性对照， 用PBS 代替一抗作阴性对照 。

　　1.3　结果判定　以细胞核或细胞质(以细胞质为主) 棕褐色着色为阳性细胞，在高倍镜视野(×200)下计数1000个细胞，其中阳性细胞数与总细胞数比值即为蛋白阳性表达率。蛋白表达阳性率在≤10%为(-)，~25%为(+)，~50%为(++)，﹥50%为(+++)。将﹥10%(+～+++)者例数相加作为阳性例数。

　　1.4　统计学处理　采用SPSS 11.5软件，对数据进行χ2检验(Pearson Chi-square或Fsher's Exact Test)和两样本均数比较t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　AAA与正常腹主动脉组织中 MMP-2的表达 70例AAA组织中MMP-2蛋白表达阳性率为94.28%(64/70)，阳性表达主要位于AAA中膜细胞质(图1);15例正常腹主动脉壁组织中MMP-2蛋白表达阳性率40%(6/15)， 主要表现为弱表达，两者比较，P=0.0000(χ2=32.23)。 MMP-2蛋白的表达与AAA直径呈负相关，在瘤直径﹤5㎝、5～6㎝、﹥6㎝ 中，其阳性表达率分别为100%、96%、93.33%(χ2=13.785，P=0.032)。MMP-2蛋白表达阳性率与其他临床病理特征无关 。

　　2.2　AAA与正常腹主动脉组织中MMP-9 的表达 70例AAA组织中MMP-9蛋白表达阳性率97.14%(68/70)，阳性表达主要位于位于AAA中膜细胞质(图2);15例正常腹主动脉壁组织中MMP-9蛋白表达阳性率33.33%(5/15)，而且主要表现为弱表达，两者比较，P=0.0000(χ2=47.35)。MMP-9蛋白的表达与AAA直径呈正相关，在瘤直径﹤5㎝、5～6㎝、﹥6㎝中，其表达阳性率分别为88.89%、93.75%、100%，P=0.001 (χ2=21.649)。MMP-9蛋白的表达与AAA是否破裂有相关性，在破裂组、非破裂组中表达阳性率分别为100%、96.36%，两组比较，χ2=8.279，P=0.041 。

　　2.3　AAA与正常腹主动脉组织中TIMP-1的表达 70例AAA组织中TIMP-1蛋白表达阳性率为77.15%(54/70)， 主要位于AAA中膜细胞膜细胞质(图3);15例正常腹主动脉壁组织中MMP-9蛋白表达阳性率73.33%(11/15) χ2=0.103，P=0.991。 TIMP-1蛋白表达阳性率与AAA临床病理特征无相关性。

　　3　讨论

　　AAA是最常见的主动脉扩张性病变，近年其发病率上升[1]。AAA的形成是多种因素共同作用的复杂过程。AAA组织中降解细胞外基质蛋白水解酶活性升高是AAA发病机制一个重要方面[2，3]。 MMPs是AAA组织中最重要的蛋白水解酶。

　　MMPs是发挥细胞外间质转化功能的一类酶家族。目前根据其作用底物同将其分为三类: 间质胶原酶类;明胶酶包括MMP-2和MMP-9;间质溶解素;膜型MMP。在AAA中起作用的主要是MMP-2与MMP-9，因为它们能同时降解主动脉的弹性蛋白与胶原蛋白[4]。MMP-2 主要位于AAA 的动脉壁中膜外侧和外膜, 与成纤维细胞、平滑肌细胞共生, 特别是周围有炎症细胞浸润时MMP-2 含量更高, 说明炎症因子旁分泌参与了MMP-2 的表达[4]; MMP-2作为72kDa的酶原形成分泌，与纤维母细胞膜相结合，纤维母细胞可以使酶原移去一个氨基末端的肽后转变成65kD的活性形式[6]。MMP-9 位于动脉壁中膜外侧和外膜，但与巨噬细胞共生[5，6]。TIMP可特异性地抑制MMPs的活性, 在细胞间基质代谢调节中,是与MMPs对应的负调节剂,目前已发现TIMP-1、TIMP-2、T IMP-3和TIMP-4四种。TIMP-1是一种分子量为30 kD 的糖蛋白,对所有MMPs均有抑制作用。通常TIMP-1与MMP酶原结合成1∶1 的复合物, 从而阻止酶原的激活。但当酶原已被激活时, 它也可直接抑制酶活性。

　　本研究中我们发现MMP-2蛋白表达阳性率AAA组织中明显高于正常腹主动脉壁，两组间有明显统计学差异。MMP-2蛋白的表达与AAA直径表现为负相关。MMP-2蛋白表达阳性率与其他临床病理特征无关。因此我们认为MMP-2在AAA起始、发病中起重要作用。MMP-2是小AAA中主要的弹性裂解酶。MMP-9蛋白表达阳性率AAA组织中明显高于正常腹主动脉壁，两组间有明显统计学差异。MMP-9蛋白的表达与AAA直径表现为正相关性 。MMP-9蛋白的表达与与AAA是否破裂有相关性，两组间有明显统计学差异。因此我们认为MMP-9在后期AAA动脉瘤扩张和破裂中起主要作用。MMP-9可以预测AAA的自然病程，作为AAA手术治疗指征之一。TIMP-1蛋白表达阳性率AAA组织中与正常腹主动脉壁没有明显统计学差异。 而且TIMP-1蛋白表达阳性率与AAA的临床病理特征无相关性。 正是这样抑制和被抑制的失衡最终导致AAA发生

　　腹主动脉重建术和腔内隔绝术使AAA的手术治疗有了很大进展。由于手术治疗有一定的风险和局限性,对于瘤体较小,近期破裂几率较低的AAA是否采用手术治疗一直存在争论[7]。人们期望通过对AAA发病机制研究，采用药物、基因等手段对AAA进行病因学治疗,达到控制AAA生长,预防其破裂的目的。一个可能的策略就是通过药物直接抑制引起动脉瘤壁中基质蛋白变性的蛋白酶来限制动脉瘤的生长[8]，这种方法不但可以保留结缔组织蛋白，而且利于组织修复使动脉壁稳定和强健。人工诱导TIMP-1或阻断MMP-2、9的表达可能抑制AAA的发生发展,有望成为AAA治疗新的辅助手段。

　　【参考文献】

　　[1] Spurgeon D. US screening programme shows high prevalence of aortic aneurysm[J]. BM J, 2004,10;328(7444):852.

　　[2] Kadoglou NP, Liapis CD. Matrix metalloproteinases: contribution to pathogenesis, diagnosis, surveillance and treatment of abdominal aortic aneurysms[J]. Curr Med Res Opin, 2004, 20(4):419-32.

　　[3] Ailawadi G, Eliason JL, Upchurch GR Jr. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm[J]. J Vasc Surg, 2003,38(3):584-8.

　　[4] Kuzuya M, Iguchi A. Role of matrix metalloproteinases in vascular remodeling[J]. J Atheroscler Thromb, 2003,10(5):275-82.

　　[5] Yamashita A, Noma T, Nakazawa A, et al. Enhanced expression of matrix metalloproteinase-9 in abdominal aortic aneurysms[J]. World J Surg, 2001,25(3): 259-265.

　　[6] Thomson R, Parks W. Role of matrix metalloproteinases in abdominal aortic aneurysms[J]. Ann NY Acad Sci, 1996,800: 157-174.

　　[7] Harthun NL, Cheanvechai V, Graham LM, et al. Prevalence of abdominal aortic aneurysm and repair outcomes on the basis of patient sex: Should the timing of intervention be the same?[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2004,127(2):325-328.

　　[8] Carmelier P: Proteinases in cardiovascular aneurysms and rupture: targets for therapy?[J]. J Clin Invest, 2002,105(11): 1519-1520.