T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1与胃癌细胞侵袭移行能力的相关性研究

　　作者：朱金明　余佩武　李翠芳　赵永亮 作者单位：1第三军医大学附属西南医院　普通外科 (重庆　400038) 2邢台市第五人民医院　内二科　(河北　邢台　054027)

　　【摘要】 目的：检测T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam 1)在胃癌细胞株中的表达并分析其与胃癌细胞侵袭、移行能力的关系。方法：采用层黏连蛋白黏附法，从胃癌MKN-45细胞株(MO)中筛选获得高黏附亚株(MH)和低黏附亚株(ML)。应用RT-PCR和SABC免疫组化技术分别检测Tiam 1 mRNA与蛋白在MO、ML、MH细胞中的表达。应用Boyden小室测定MO、ML、MH细胞的体外侵袭、移行能力并分析其与Tiam 1表达间的关系。结果：胃癌MKN-45细胞高黏附亚株(MH)的体外侵袭、移行能力均较MKN-45细胞(MO)及其低黏附亚株(ML)为强(P< 0.05)，但MO与ML细胞间无差异(P>0.05)。Tiam 1 mRNA和蛋白在MH细胞中的表达均较其在MO和ML细胞中的表达为强(P<0.05)，但在MO与ML细胞中的表达无差异 (P> 0.05)。Tiam 1蛋白和mRNA表达水平与胃癌细胞体外侵袭、移行能力呈正相关 (P<0.05或P<0.01)。结论：Tiam 1基因表达水平升高有可能促进胃癌细胞侵袭、移行能力的增强。

　　【关键词】 胃肿瘤　T淋巴瘤侵袭转移诱导因子　侵袭转移

　　Correlation between Tiam 1 and the invasive and migratory potential of gastric cancer cells

　　ZHU Jin-ming1, YU Pei-wu1, LI Cui-fang2, ZHAO Yong-liang1

　　1Department of General Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University(Chongqing 400038,China)

　　2Department of Internal Medicine, Fifth People's Hospital, Xingtai, HeBei Province(Xingtai 054027, China)

　　【ABSTRACT】 Objective: To investigate the expression of T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1 (Tiam 1) in gastric cancer cell lines and analyse the correlation between Tiam 1 and the invasive and migratory potential of gastric cancer cells. Methods: Two subpopulations of human gastric cancer cell line MKN-45 (MO), less adhesive subgroup (ML) and higher adhesive subgroup(MH) were separated by laminin adhesion method in vitro. RT-PCR and SABC immunohistochemical technique were applied to detect the expression of Tiam 1 mRNA and protein in MO, ML and MH cells. The invasive and migratory potential of MO, ML and MH cells in vitro were observed by Boyden chamber, simultaneously the correlation between the expression of Tiam 1 and the invasive and migratory potential of gastric cancer cells also was analysed. Results: The invasive and migratory potential of MH cells was much higher than that of MO and ML cells (P<0.05), so did the expression of Tiam 1 mRNA and protein in MH cells (P<0.05), but there was no obvious difference between that in MO and ML cells (P>0.05). Positive correlation existed between the expression of Tiam 1 and the invasive and migratory potential of gastric cancer cells (P<0.05 or P<0.01). Conclusion: Increasing expression of Tiam 1 gene might promote the invasive and migratory potential of gastric cancer cells.

　　【KEY WORDS】 Gastric cancer· Tiam 1·Invasion·Migration

　　肿瘤细胞的侵袭、转移与其运动能力密不可分，细胞骨架特性则是影响其运动能力的结构基础之一。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1( T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam 1)作为重要的细胞骨架结构调节因子，已被证明与乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关[1,2]，但目前尚缺乏Tiam 1与胃癌细胞间关系的研究。2005年以来，我们通过检测Tiam 1在具有不同黏附及侵袭、移行能力的胃癌细胞中的表达，初步探讨了Tiam 1表达与胃癌细胞侵袭、移行的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1　主要试剂　RPMI 1640培养基、小牛血清(fcs)和胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，层黏连蛋白(美国Sigma公司)，Boyden小室(美国Millipore公司)，Matrigel人工基质(美国BD公司)，TriPure试剂(德国宝灵曼公司)，第一链cDNA合成试剂(上海Sangon公司)，DNA聚合酶(大连Takara公司)，DNA Ladder(美国MBI公司)，兔抗人/鼠Tiam 1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，即用型SABC检测试剂盒和DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。

　　1.2　胃癌细胞高、低黏附亚株的筛选　胃癌MKN-45细胞株(MO)购自上海仁济医院、上海市消化疾病研究所，置于含10% fcs的RPMI 1640培养液中，在37℃饱和湿度、5%CO2条件下培养，其高、低黏附亚株系经“层黏连蛋白黏附法”筛选分离获得[3]。将对数生长期的MKN-45细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，计数并经台盼蓝拒染测细胞活力>95%后，接种于包被有层黏连蛋白的d=35cm培养皿中，细胞数为2.5×105个/皿。常规孵育1h后，将未贴附细胞转移至另一培养瓶中，加含10% fcs的RPMI 1640使之生长扩增;已贴附于培养皿的细胞亦加含10% fcs的RPMI 1640扩增。当贴附细胞生长达一定数量后再重复上述过程，收集更高黏附力的细胞;未贴附细胞扩增后亦再加入包被有层黏连蛋白的培养皿中，收集更低黏附力的细胞。以上两过程各重复20次，最后建立MKN-45细胞低黏附亚株(ML)和高黏附亚株(MH)。实验所用均为末次筛选所得ML、MH传代5次以内的细胞。

　　1.3　胃癌细胞中Tiam 1表达的检测

　　1.3.1 RT-PCR及结果判定 总RNA提取依TriPure操作说明进行，紫外分光光度仪定量并确保A260 / A280=1.7~2.0。各取1μg总RNA逆转录合成cDNA。Tiam 1引物为：5'-TTC TCA CCA GTC TGT TCA GC-3'，5'-CCA GAC TTG GAA TCC TCA GA-3';内参照GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)引物为：5'-AGG TCC ACC ACT GAC ACG TT-3'，5'-GCC TCA AGA TCA TCA GCA AT-3'。PCR反应体系为：2μl cDNA，5μl 10×Buffer，4μl 25mmol/L MgCl2，8μl 2.5mmol/L dNTPs，25μmol/L上下游引物各0.5μl，5u/μl DNA聚合酶0.5μl，以ddH2O加至总体积为50μl，石蜡油覆盖。Tiam 1和GAPDH的扩增参数均为：94℃预变性3min，“94℃，45s，54℃，1min，72℃，1.5min”进行30次循环后，72℃延伸5min。

　　PCR产物在含EB的2%琼脂糖凝胶中电泳，Tiam 1、GAPDH基因扩增片段长度分别为818bp、310bp。采用MIG2000图象分析系统测定各样本上述目标条带的V值(V=平均吸光度值×条带面积)，Tiam 1 mRNA表达强度值Rv = VTiam 1 / VGAPDH。

　　1.3.2　免疫组化及结果判定　将胃癌细胞爬片以丙酮室温固定10min，一抗(1∶100)37℃孵育1h，生物素标记的二抗37℃孵育20min，SABC复合物37℃孵育20min，DAB显色，不复染，中性树胶封片。每组染色均以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　染色结果以细胞膜及细胞质呈黄色为阳性，采用MIG2000图象分析系统随机测定100个细胞，分别计算出阳性染色细胞的总面积(Area)与积分光密度(IOD)，Tiam 1蛋白表达强度值Dλ = IOD / Area。

　　1.4　胃癌细胞体外侵袭移行能力的检测　采用Boyden小室法[4]，于4℃环境中在Boyden小室滤膜上均匀包被人工基质Matrigel备用。

　　1.4.1　条件培养液制备　选用Balb/C小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，消毒剥离其皮肤并剪成1mm3大小的组织块，置于含10% fcs的RPMI 1640培养液中，在37℃饱和湿度、5%CO2条件下孵育。当小鼠皮肤成纤维细胞由组织块游出并生长密集后，清除组织块并以胰蛋白酶消化传代。待传代细胞生长密度达80%时换用无血清RPMI 1640培养液继续培养24h，然后收集培养上清，以0.2μm滤膜过滤分装，-20℃冻存备用。

　　1.4.2 体外移行实验 将处于对数生长期的Mo、ML、MH细胞以胰蛋白酶消化成单细胞悬液，台盼蓝拒染测细胞活力> 95%，调整细胞浓度为2.5×105/ml。将无Matrigel包被的Boyden小室置于24孔培养板孔中，在每一Boyden小室的下室加条件培养液0.6ml，上室加细胞悬液0.4ml。常规培养12h后，取出Boyden小室拭去其滤膜上表面的未迁移细胞，行HE染色，高倍镜下计数穿透滤膜并黏附于其下表面的细胞数。每一亚株设3室，计算其平均值。

　　1.4.3　体外侵袭实验　将处于对数生长期的Mo、ML、MH细胞以胰蛋白酶消化成单细胞悬液，台盼蓝拒染测细胞活力>95%，调整细胞浓度为2.5×105/ml。将包被有Matrigel的Boyden小室置于24孔培养板孔中，在每一Boyden小室的下室加条件培养液0.6ml，上室加细胞悬液0.4ml。常规培养72h后，取出Boyden小室拭去其滤膜上表面的未迁移细胞，行HE染色，高倍镜下计数穿透滤膜并黏附于其下表面的细胞数。每一亚株设3室，计算其平均值。

　　1.5　统计学处理　应用SPSS10.0统计软件，计量资料采用单因素方差分析-均数间差别多重比较的LSD检验，相关分析采用双变量间的Pearson检验。P<0.05为差异有统计学意义 。

　　2　结果

　　2.1　Tiam 1在胃癌MKN-45细胞及其高、低黏附亚株中的表达情况　RT-PCR结果显示，Tiam 1 mRNA在MH细胞中的表达水平皆高于其在MO及ML细胞中的表达，P<0.05(图1)。Tiam 1蛋白在MH细胞中的阳性染色呈棕黄色，远较其在MO、ML细胞中的淡黄染色为强，差异显著(P<0.05)，但Tiam 1 mRNA表达和蛋白染色强度在MO、ML细胞间差异均不显著(P>0.05)，详见表1与图2。

　　2.2　胃癌MKN-45细胞及其高、低黏附亚株的体外移行能力比较　MH细胞跨越Boyden小室滤膜网孔的能力均高于MO细胞及其ML细胞，P<0.05，但在MO和ML细胞间其体外移行能力无明显差异(P>0.05)。见表2。

　　2.3　胃癌MKN-45细胞及其高、低黏附亚株的体外侵袭能力比较　MH细胞亚株对包被有Matrigel基质的Boyden小室滤膜网孔的侵袭穿透能力均高于MO细胞及其ML亚株，差异显著(P<0.05)，但在Mo和ML细胞间其体外侵袭穿透能力无明显差异(P>0.05)。见表2。

　　2.4　Tiam 1表达与胃癌细胞体外侵袭、移行能力的相关性　Tiam 1 mRNA表达水平与胃癌细胞MO、ML、MH的体外侵袭、移行能力均呈正相关(相关系数分别为r = 1.000和0.998)，统计学意义显著或非常显著(P<0.05或P<0.01)。Tiam 1蛋白合成水平与胃癌细胞MO、ML、MH的体外侵袭、移行能力也均呈正相关(相关系数分别为r = 0.995和0.988)，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

　　3　讨论

　　Tiam 1是Dbl(diffuse B-cell lymphoma oncogene family)家族成员，可作为Rho蛋白的特异性鸟苷酸转换因子，促进其向活化状态转变，进而调节细胞骨架结构重组与形体极化，促进细胞运动和迁移[5-7]。通常Tiam 1基因除在人大脑和睾丸组织中表达外，在其它正常组织中不表达或仅呈低度表达。cDNA序列分析显示，Tiam 1和原癌基因Dbl、Ect-2、Vav同源。近年的研究表明，Tiam 1在T / B细胞淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤细胞中呈阳性表达，且与其侵袭转移密切相关[1,2]。

　　本实验借助“层黏连蛋白黏附法”，由人胃低分化管状腺癌来源的MKN-45细胞株(MO)中，筛选获得起源相同但表型有异的高、低黏附亚株(MH和ML)[3]。经Boyden小室法检测发现，高黏附亚株MH的体外侵袭、移行能力均强于母系MO及其低黏附亚株ML，差异显著(P<0.05)。经基因及蛋白水平检测，我们还发现Tiam 1 mRNA和蛋白在MH细胞中的表达均强于其在MO、ML细胞中的表达，差异显著(P<0.05);但Tiam 1 mRNA表达和蛋白染色强度在MO、ML细胞间无明显差异(P>0.05)。进一步的相关分析显示，Tiam 1 蛋白和mRNA表达水平与MO、ML、MH细胞的体外侵袭、移行能力成正相关，统计学意义显著(P<0.05)。以上研究结果提示，Tiam 1表达水平升高可能促进胃癌细胞侵袭、移行能力的增强。

　　已知细胞骨架在维持细胞形态和运动的同时，还可整合内、外源信号，参与细胞分泌、接触抑制、增殖和凋亡等多种生命活动[8]。研究发现，在肿瘤细胞中过量表达的Tiam 1可经PI3-K途径激活Rho蛋白，既可诱使整合素α6β1迁移到肿瘤细胞周边特异的黏着部位，促进异质型黏附，也可将整合素α6β1募集于细胞头部与伪足处，传递调节信号至细胞骨架，影响肌动蛋白微丝组配，增强肿瘤细胞的运动和侵袭[9]。另外，Tiam 1还可通过分子结构中PHn-CC-Ex功能域与CD44V3单体耦联，介导肿瘤细胞与胞外基质成分-透明质酸的结合，促进其侵袭、转移[10]。本实验筛选模型中所得MH细胞与层黏连蛋白的黏附力强于ML、MO细胞，而MO、ML细胞间无明显差异[3]。层黏连蛋白是基膜和细胞外基质(ECM)的主要成分，肿瘤细胞可通过位于其表面的黏附分子与层黏连蛋白结合，实现定植并引发ECM降解和细胞穿透移行[11]。因此，MH、ML、MO细胞中Tiam 1表达存在显著差异的现实提示我们，究竟MH、ML、MO细胞侵袭、移行能力的不同是缘于其细胞表面层黏连蛋白相关黏附分子表达量或分布的不同，还是缘于在Tiam 1-细胞骨架-细胞黏附分子-ECM间存在着某些可能的调控机制，尚有待深入探讨。

　　【参考文献】

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　　[2] Minard ME, Herynk MH, Collard JG, et al. The guanine nucleotide exchange factor Tiam1 increases colon carcinoma growth at metastatic sites in an orthotopic nude mouse model[J]. Oncogene, 2005,24(15)：2568-2573.

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　　[8] Pawlak G, Helfman DM. Cytoskeletal changes in cell transformation and tumorigenesis[J]. Curr Opin Genet Dev, 2001,11(1)：41-47.

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　　[10] Bourguignon LY, Zhu H, Shao L, et al. CD44 interaction with tiam1 promotes Rac1 signaling and hyaluronic acid-mediated breast tumor cell migration[J]. J Biol Chem, 2000,275(3)：1829-1838.

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