热休克蛋白70在肝脏缺血再灌注损伤中的作用

　　作者：刘雷，段佳佳 作者单位：1. 广西柳州市工人医院，广西医科大学第四附属医院普外科，广西 柳州 545005　2. 广西医科大学第一附属医院普外科，广西 南宁 530021

　　【关键词】 肝 缺血再灌注损伤 热休克蛋白质70 细胞凋亡

　　在较为复杂的肝肿瘤切除、严重的肝创伤手术过程中，通常需要暂时阻断肝脏血流，这一过程可引起不同程度的肝脏缺血—再灌注损伤。肝脏的缺血—再灌注损伤与多种因素有关，包括氧自由基的释放、钙超载、Kuffer细胞的激活、细胞因子的释放等。为了减轻肝门血流阻断引起的缺血—再灌注损伤，人们进行了很多尝试，包括短暂缺血、药物、热应激等的预处理，其保护作用的机制均与诱导产生热休克蛋白(heat shock protein, HSP)有关[1]。

　　HSP是生物在不利环境下产生的一种非特异性产物，结构具有高度保守性。因最先发现于热应激反应中故而得名。此后发现其它应激因素如：缺血、缺氧、感染、创伤、低温、多种毒素等均可诱导HSP的合成。各种应激因素诱导HSP合成后，机体相应的适应能力如耐热、耐低温、抗感染等能力明显增加。该家族成员根据分子量大小可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP28等几大类，其中一类蛋白质分子量约为 70kD，称为 HSP70[2]。

　　1 HSP70的分子学特征

　　HSP70家族(分子量为72～80kD)成员众多，共有21种蛋白质，是一组在进化上高度保守的应激蛋白。人类的HSP70家族的部分基因定位于第1，5，6(在MHC基因位点内)，9，14和21号等染色体上[3]。HSP70由两部分组成，ATP酶区(adenosine triphosphate-pase domain)和底物识别区，又称多肽结合区(peptide-bind domain)。多肽与HSP70分子结合和释放是一个依赖ATP的过程。HSP70蛋白的多肽结合区是羧基端的约27kD的氨基酸片段，能与主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)抗原结合[4]。

　　2 HSP70的功能机制

　　2.1 分子伴侣作用 分子伴侣(molecular chaperones)是指帮助新合成及分解折叠蛋白正确折叠和成功组装而本身不具备功能的最终装配产物的组成蛋白。HSP70是主要的分子伴侣蛋白(chaperonin)。它参与识别和稳定胞浆内蛋白质折叠成天然状态前的伸展多肽链;帮助分泌蛋白质与线粒体蛋白分别进入内质网管腔或线粒体基质，并在其进入这些细胞器后折叠成天然构象前稳定其伸展状态;参与蛋白寡聚体的重排与蛋白质凝聚物的解体和快速转换的胞浆蛋白进入溶酶体的降解;参与细胞质的内吞噬作用等。当蛋白质受损变性时，能促使其恢复或加速其降解和清除，以维护细胞的功能[5]。

　　2.2 抗氧化作用 HSP具有抗氧化能力。HSP可抑制产生氧自由基的关键酶即NADP氧化酶，通过反馈作用减少氧自由基的产生;还可直接释放和增加内源性过氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的水平[6]，由于SOD能催化氧自由基发生歧化反应从而除去氧自由基，故有细胞保护作用。

　　2.3 协同免疫作用 当刺激因素引起机体细胞免疫应答时，不但有各种细胞因子(IL-1、IL-2、TNF-α 等)产生，同时亦伴有HSP的产生，以对抗细胞因子对细胞的损害作用，HSP70可抑制人的单核细胞产生IL-1和TNF[7]，保护细胞免受细胞因子攻击。

　　2.4 抗细胞凋亡作用 应激诱导的细胞凋亡需要激活细胞内应激酶(jun N-teriminal kinase, JNK)[8]。细胞内HSP70水平增高可以阻断信号通路，抑制应激诱导的JNK激活，从而减少细胞凋亡。

　　2.5 参与细胞耐热和细胞保护 在各种细胞器中，核仁和细胞膜对热特别敏感。HSP70广泛存在于细胞骨架和核骨架内，与核仁和细胞膜结合，从而提高细胞对热的耐受力。

　　2.6 抗原库的作用 HSP在抗原呈递过程中结合大量抗原性多肽，从而具有该细胞特有的抗原库的作用。HSP-多肽复合物的抗原性来自于所结合的多肽分子，而非HSP本身。HSP通过参与抗原呈递而起作用。

　　3 HSP70在肝缺血再灌注中的作用

　　3.1 肝缺血再灌注中HSP70的诱导 目前研究发现[9]，肝脏缺血在60min以内血供恢复，肝细胞结构和功能能够恢复，但肝细胞内会发生一系列变化，包括c-fos，c-myc，HSP基因等的激活、表达。其中HSP70的诱导非常明显，可达到经热休克诱导的表达水平。同时也有研究表明[10]，长时间(90～120min)单纯肝缺血并不能激活HSP70基因，HSP70 mRNA只有在肝脏发生缺血再灌注(60min)区才有表达，而在非缺血区则无表达。这表明肝缺血再灌注损伤主要发生在再灌注期。也有研究认为[11]，肝组织HSP mRNA水平还能作为肝缺血再灌注损伤程度的指标之一。

　　3.2 肝缺血再灌注损伤中HSP的表达 目前的研究表明[12]，肝缺血(60min)末HSP70 mRNA的转录即启动，再灌注2h开始升高，至少持续5h，再灌注15h后消失。而HSP表达在再灌注3h可检测到，且主要位于细胞核，在48～72h达高峰，96h后开始消失。肝缺血120min将引起细胞不可逆性损伤，导致细胞坏死。而缺血60min和120min都能引起编码HSP70基因的转录增强，只是后者的这种基因转录维持时间较短。Zhu X等研究发现[13]，在阻断入肝血流的同时行门体分流以消除门静脉淤血或仅阻断肠系膜上静脉而无肝缺血，则肝组织几乎均无HSP70的表达，在伴门静脉淤血的肝脏热缺血15min再灌注48h后，肝组织内HSP70表达显著增强，在不利的环境条件下，HSP70蛋白能够优于细胞内其他蛋白质的合成，甚至在其他蛋白质合成抑制时依然显示出高水平表达。HSP70在再灌注损伤应激状态下表现为优先及高效翻译，该现象可能是肝细胞对应激的适应性反应。

　　3.3 HSP70对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

　　3.3.1 缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)与HSP70 缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用已有文献报道，研究发现[14]，用Pringle法阻断入肝血流15min恢复48h后在肝组织内诱导的HSP70大量表达，加快了再灌注期间肝功能恢复及提高了术后生存率。杨恒文等[15]采用了3次10min预处理，结果比较理想。因此，IPC可能是通过增加内源性抗氧化酶活力而发挥对缺血再灌注损伤的保护作用的，但它通过什么途径增强抗氧化酶活力尚待进一步研究。

　　3.3.2 热应激预处理与HSP 研究发现[16]，正常大鼠在热休克预处理后48h即HSP表达的高峰期给予30min的入肝血流阻断(Pringle法)，其再灌注期间反映肝功能损害的生化指标如肝组织ATP水平、血清生化酶水平，如谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)等均较未行热休克预处理的对照组大鼠好，并且上述生化指标的恢复亦较快，热休克预处理组大鼠的7天生存率为100%，而对照组为50%。还有研究发现[14]，在脂肪肝模型大鼠中，行热休克预处理后48h，肝组织内亦有HSP70的显著表达，且在热缺血45min再灌注40min后肝组织的ATP水平、血清生化酶(AST、ALT、LDH)水平明显好于对照组;实验组术后7天生存率为86.7%，而对照组仅为33.3%。组织学检查也证实对照组的肝窦状隙严重淤血、肝细胞坏死，而热休克预处理组却无明显改变。在肝纤维化模型大鼠中的研究亦表明，热休克预处理组也能明显诱导其肝组织内HSP70的表达，并明显减轻纤维化肝脏的缺血再灌注损伤[1]。

　　近年来研究表明，肝脏缺血再灌注后的炎症反应是导致组织细胞损伤的重要因素。肝脏缺血再灌注早期即有枯否细胞的激活，并产生大量活性氧物质(radical oxygen species, ROS)和许多炎性细胞因子。在细胞趋化因子，细胞黏附分子等共同作用下，使PMN趋化、黏附、聚集、活化，进而介导炎症反应。PMN介导再灌注损伤的机制包括阻塞微小血管，加重微循环障碍;释放活性氧产物和蛋白酶;增加血管通透性，引起组织水肿等。尽管HSP在保护肝缺血再灌注损伤的确切机理仍不清楚，由于其作为细胞一种内源性保护物质具有普遍存在性。找到这些内源性保护机制中的重要环节，将对临床肝胆外科有重要的指导意义。

　　【参考文献】

　　[1] Man K, Ng KT, Lee TK, et al.FTY720 attenuates hepatic ischemia reperfusion injury in normal and cirrhotic livers [J]. Am J Transplant，2005,5(1):40-491.

　　[2] Zacharow skiK, Frank S, Otto M, et al. Lipoteichoic acid induces delayed protection in the rat heart. A comparison with endotoxin [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(6):1521-1528.

　　[3] Nomura F, Aoki M, Forbess JM, et al. Myocardial self-preservative effect of heat shock protein70 on an immature lamb heart [J]. Ann-Thorac Surg,1999,68(5):1736-1741.

　　[4] Abdel All H, Rey A, Duvillard P. Expression of heat shok protein 70 and c- myc in cervical carcinoma [J]. Anticancer Res,1998,18(3):1533-1536.

　　[5] Carbajal ME, Valet JP, Charest PM, et al. Purification of Drosophila HSP83 and immunoelectron microscopic localization [J]. Eur J Cell Biol,1990,52(1):147-156.

　　[6] Kobayashi H, Nonami T, Kurokawa T, et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia -reperfusion injury in rat liver [J]. J Surg Res,1995,59(6):772-779.

　　[7] Zlotta AR, Drowart A, Huygen K, et al. Humoral response against heat shock proteins and other mycobacterial antigens after intravesical treatment with bacille Calmette-Guerin (BCG) in patients with superficial bladder cancer [J]. Clin Ex P Immunol，1997,109(1):157-165.

　　[8] Wullaert A, Heyninck K, Beyaert R, et al. Mechanisms of crosstalk between TNF-induced NF-kappa B and JNK activation in hepatocytes [J]. Biochem Pharmacol,2006,72(9):1090-1101.

　　[9] Matsumoto K, Honda K, Kobayashi N, et al. Protective effect of heat preconditioning of rat liver graft resulting in improved transplant survival [J]. Transplantation,2001,71(7):862-868.

　　[10] Sakai T, Takaya S, Fukuda A, et al. Evaluation of warm ischemia- reperfusion iniury using heat shock protein in the rat liver [J]. Transpl Int,2003，16(2):88-99.

　　[11] Inagaki K, Kihara Y, Hayashida W, et al. Anti-ischemia is effect of a novel cardio protective agent, JTV519, is mediated through specific activation of delta-isoform of protein kinase C in rat ventricular myocardium [J]. Circulation,2000,101(7):797-804.

　　[12] Wu S, Li HY, Wong TM. Cardioprotection of preconditioning by metabolic inhibition in the rat ventricular myocyte Involvement of k-opioid receptor [J]. Circ Res,1999,84(12):1388-1395.

　　[13] Zhu X, Dai Chao-liu, et al. Ischemic preconditioning attenuates ischemia-reperfusion injury of cirrhotic liver in rats [J]. Journal of Clinical and Experimental Medicine,2005,5:57-64.

　　[14] Bedirli A, Sakrak O, Muhtaroglu S, et al. Ergothioneine pretreatment protects the liver from ischemia-reperfusion injury caused by increasing hepatic heat shock protein 70 [J]. J Surg Res,2004,122(1):96-1021.

　　[15] 杨恒文,曾琳,杜晓兰.缺血预处理对肝再灌注损伤的保护作用[J].第三军医大学学报,2000,11(1):8.

　　[16] Chen H, Yu YY, Zhang MJ, et al. Protective effect of doxorubicin induced heat shock protein72 on cold preservation injury of rat livers [J]. World J Gastroenterol,2004,10(9):1375-1378.