MT1MMP对人肝癌细胞浸润能力的影响

　　作者：孟刚 张扬 蔺勇 田莉 王广义 作者单位：吉林大学第一医院普外科，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 观察膜型基质金属蛋白酶1(MT1MMP)对人肝癌细胞株浸润能力的影响，并初步探讨其作用机制。方法 将稳定表达MT1MMP基因转染至HepG2细胞中，应用Western印迹法检测MT1MMP蛋白表达;明胶酶谱分析法检测MMP2酶原活性;体外侵袭实验检测细胞株浸润能力。结果 重组质粒转染株MT1MMP蛋白表达水平明显高于空质粒组和未转染组(P<0.01)。明胶酶谱分析实验发现，MT1MMP组同时检测到72 000酶原形式和64 000活性形式的MMP2，另两组只检测到72 000酶原形式的MMP2。体外侵袭实验结果显示，MT1MMP组细胞穿过基质胶(Matrigel)的细胞数目明显多于其他两组(P<0.01)。结论 MT1MMP能显著增强肝癌细胞株的浸润能力，其机制主要是通过激活MMP2酶原，降解肿瘤周围的基质成分实现的。

　　【关键词】 膜型基质金属蛋白酶1;基质金属蛋白酶2;浸

　　Effects of MT1MMP on the invasiveness of human hepatocellular carcinoma cells in vitro

　　MENG Gang，ZHANG Yang，LIN Yong,et al.

　　Department of General Surgery，the First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，Jilin，China

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of membrane type1 matrix metalloproteinase (MT1MMP) on the invasiveness of human hepatocellular carcinoma cells and to investigate its mechanisms.Methods HepG2 with overexpression of MT1MMP were established by stable transfection.MT1MMP protein was detected by Western blot.Latent proMMP2 and MMP2 activity were analyzed by gelatin zymography.The invasiveness of cell strain was measured by invasion chamber coated with Matrigel.Results MT1MMP protein level of HepG2 cells that transfected with the recombinant vector was obviously higher than that of empty vector group and that of control group (P<0.01).There were both 72 000 precursor form and 64 000 active enzyme form of MMP2 in group that transfected with the recombinant vector，but there was only 72 000 precursor form of MMP2 in empty vector group and control group.The largest amount of cells penetrated through Matrigel was observed in group that transfected with the recombinant vector than that in the other two groups (P<0.01).Conclusions MT1MMP can remarkably promote the invasive potential of hepatocellular carcinoma cells mainly through its ability of activating latent proMMP2 to degrade extracellular matrix.

　　【Key words】 MT1MMP;MMP2;Invasion

　　肿瘤细胞对细胞外基质(ECM)和基底膜成分的降解是肝癌发生浸润和转移的先决条件，基质金属蛋白酶(MMPs)是此降解过程中重要的酶类。膜型基质金属蛋白酶1(membrane type1 MMP，MT1MMP)是新近所知的MMPs成员，其不仅能激活明胶酶A酶原(proMMP2)，促进MMP2对多种基底膜成分的降解，而且自身也可直接发挥降解ECM的作用〔1〕。已有研究证实〔2，3〕，MT1MMP能够促进肝癌浸润和转移。我们利用人肝癌细胞株HepG2，进一步研究MT1MMP对肝癌细胞株浸润能力的影响，并初步探讨其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人肝癌细胞株HepG2和pcDNA3.1/MT1MMP真核表达质粒由本院中心实验室保存;脂质体Lipofectamine 2000及G418均购自Invitrogen公司;DMEM培养基和胎牛血清为Gibco产品;兔抗人MT1MMP多抗购自NeoMarkers公司;兔抗人βactin多抗、HRT标记的羊抗兔IgG及proMMP2均为北京鼎国生物技术有限公司产品;基质胶(Matrigel)购自BD公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞转染和筛选培养

　　取对数生长期HepG2细胞重悬于DMEM培养液中，以4×105个细胞/孔接种于6孔板中，培养24 h，使细胞60%～70%融合。按Lipofectamine 2000试剂盒说明转染空质粒(空质粒组)和重组质粒(MT1MMP组)，并设未转染组。转染48 h后换液，加800 g/L G418进行筛选，4 w后未转染组细胞全部死亡，G418浓度调至250 g/L继续筛选。分离抗G418阳性克隆，用选择培养液扩大培养。

　　1.2.2 Western印迹检测MT1MMP蛋白表达

　　收集各组细胞，分别提取总蛋白，测定蛋白含量。灌注10% SDSPAGE凝胶。每孔上样量20 μg，经电泳、转膜、封闭，加入MT1MMP一抗(稀释度1∶500)4 ℃孵育过夜。兔抗人βactin多抗(稀释度1∶200)作为内参。HRT标记二抗(稀释度1∶1 000)室温孵育1 h后，DAB显色观察。应用凝胶成像分析系统定量分析条带。

　　1.2.3 明胶酶谱分析法测定MMP2的活性

　　收集各组细胞培养上清离心，去除细胞碎片，烘干，测定蛋白含量。每孔20 μg上样于聚丙烯酰胺凝胶行电泳，10%分离胶中加入1%明胶。凝胶分别经洗涤45 min，漂洗20 min，37℃孵育48 h，染色2 h后，不同浓度脱色液脱色。应用凝胶成像分析系统定量分析条带。

　　1.2.4 细胞体外侵袭实验

　　8 μm的硝酸纤维素微孔滤膜上均匀涂上Matrigel(1∶5稀释)，37℃放置3 h备用。向Boyden小室的上室中加入细胞悬液25 μl，下室各孔加入25 μl无血清培养24 h的NIH3T3细胞上清液。每孔设3个复孔，常规培养24 h，取出膜，用棉签拭去膜上室面细胞，70%甲醛室温固定45 min，HE染色后，在倒置显微镜下随机选取10个200×视野，计数穿膜细胞数目，取均值。实验重复3次。

　　1.3 统计学方法

　　数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件进行组间t检验。

　　2 结 果

　　2.1 稳定表达株的筛选与MT1MMP蛋白的表达

　　将pcDNA3.1/MT1MMP质粒转染HepG2细胞，经4 w选择性培养(250 g/L G418)后，得到了稳定表达目的基因的阳性细胞株。Western印迹检测发现，MT1MMP组细胞检测到MT1MMP蛋白的表达，而空质粒组和未转染组几乎观察不到MT1MMP蛋白条带(图1)。

　　2.2 MMP2的酶活性检测

　　明胶酶谱分析发现，未转染组和空质粒组在72 000位置检测到MMP2的酶解条带，而MT1MMP组该位置的酶解条带明显减弱，在64 000处出现新的酶解条带(图2)。

　　2.3 细胞浸润能力的检测

　　体外侵袭实验结果显示，HepG2细胞培养24 h后MT1MMP组、空质粒组和未转染组浸润至硝酸纤维素微孔滤膜下的细胞数分别为(103.7±16.5)、(41.3±13.1)、(38.5±11.7)/HP。MT1MMP组浸润至膜下的细胞数明显高于其他两组(P<0.01)。空质粒组和未转染组比较差异不显著(P>0.05)。

　　3 讨论

　　浸润和转移是肝癌最重要的生物学特征，也是防治肝癌的难点。肿瘤细胞首先降解其周围的基质，进而发生浸润和转移等一系列步骤。目前研究显示，与基质降解有关的主要酶类是MMPs。MTMMPs作为MMPs的一个亚家族，可以降解大多数基质成分。本研究在体外实验中初步探讨了MT1MMP增加肝癌浸润能力的主要作用机制。

　　本实验结果显示，未转染组HepG2细胞几乎观察不到MT1MMP蛋白条带，表明MT1MMP蛋白表达量极少。MT1MMP组可以检测到该蛋白大量表达，在蛋白水平上证实了重组质粒具有显著增强MT1MMP表达的作用。亦有研究报道〔4，5〕，刀豆素A(ConA)可以诱导乳腺癌细胞株MDAMB453表达MT1MMP蛋白。

　　明胶酶谱分析实验发现，未转染组和空质粒组HepG2细胞只检测到分子量为72 000的MMP2酶原，表明该细胞株本身没有激活MMP2的能力。MT1MMP组细胞中72 000酶原形式的MMP2有所减少，同时检测到64 000活性形式的MMP2，表明重组质粒作用下产生的MT1MMP蛋白可以激活MMP2酶原，使其成为64 000活性形式的MMP2。

　　体外侵袭实验结果发现，空质粒组穿过Matrigel的数目与未转染组比较无显著差异，表明没有激活的MMP2酶原不具有降解基底膜的能力。MT1MMP组穿过Matrigel的数目明显增加，表明MT1MMP激活MMP2酶原后，具有活性的MMP2能显著降解Matrigel胶原成分，使肿瘤细胞大量穿过Matrigel形成的屏障，游走至聚碳酸酯膜下面。表明在MT1MMP促进肝癌细胞浸润正常组织的机制中，主要是激活MMP2和降解肿瘤周围基质。

　　综上所述，MT1MMP能明显增强肝癌细胞浸润能力，其机制主要是通过激活MMP2酶原，破坏基质屏障实现的。这也为临床通过抑制肝癌的浸润和转移治疗肝癌提供了新的靶点。

　　【参考文献】

　　1 Seiki M.Membranetype 1 matrix metalloproteinase：a key enzyme for tumor invasion〔J〕.Cancer Lett，2003; 194 (1)：111.

　　2 汪多平，曹骥，赵荫农，等.RECK及MMP14在肝细胞肝癌组织中的表达及其临床意义〔J〕.中国肿瘤临床，2007; 34 (10)：55861.

　　3 蔡阳，吴志全,樊 嘉,等.膜型基质金属蛋白酶1与肝细胞癌侵袭转移性的关系〔J〕.中华肝脏病杂志，2000; 8 (4)：2368.

　　4 Yu M，Sato H，Seiki M,et al.Complex regulation of membranetype matrix metalloproteinase expression and matrix metalloproteinase2 activation by concanavalin A in MDAMB231 human breast cancer cells〔J〕.Cancer Res，1995; 55 (15)：32727.

　　5 Haupt LM，Thompson EW，Trezise AE,et al.In vitro and in vivo MMP gene expression localization by in situRTPCR in cell culture and paraffin embedded human breast cancer cell line xenografts〔J〕.BMC Cancer，2006;6:18.