生长激素促进体外培养的Ｂｅｌ-７４０２肝癌细胞增殖

　　作者：刘建平， 陈涛， 陈小萱， 区庆嘉 作者单位：(中山大学附属第二医院普外科，广东 广州510120)

　　【摘要】 【目的】 了解重组人生长激素(rhGH)对体外培养的Bel-7402肝癌细胞增殖的影响。【方法】 应用放射性配体法了解GHR在Bel-7402肝癌细胞株的表达情况;采用肿瘤细胞计数、噻唑蓝比色法和集落形成实验了解Bel-7402肝癌细胞株在不同浓度rhGH(0、1、10、100、1 000、10 000 ng/mL)作用下的药物敏感性，计算细胞生长率，集落形成率;并用3H-TdR渗入法了解肿瘤细胞DNA代谢情况。【结果】 放射配体法发现Bel-7402肝癌细胞表达GHR， rhGH对体外培养的7402肝癌细胞的生长具有一定程度的刺激作用，表现为rhGH在100 ng/mL的浓度时促进肝癌细胞的增殖较为显著，而rhGH在其它浓度时(1、10、1 000、10 000 ng/mL)的部分时段，对肝癌细胞的增殖虽也能表现出一定程度的促进作用，但总体效果较rhGH 在100 ng/mL浓度时为弱。【结论】 一定浓度范围的rhGH对7402肝癌细胞的增殖有促进作用，原因可能与7402肝癌细胞表达GHR有关。

　　【关键词】 重组人生长激素; 生长激素受体; 原发性肝癌; 细胞培养; 放射配体分析法

　　RhGH Increase Proliferation of Human Hepatic Carcinoma Cell　Line Bel-7402 in Vitro

　　LIU Jian-ping， CHEN Tao， CHEN Xiao-xuan， OU Qing-jia

　　( Department of General Surgery， The Second Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510120， China )

　　Abstract： 【Objective】 To study the effect of rhGH with different concentrations on the growth of Bel-7402 human hepatic carcinoma cell lines in vitro. 【Methods】 Radioligand assay was used to detect the growth hormone receptor (GHR) expression of the hepatic carcinoma cell lines. Tumor cell count， thiazole blue chromatometry， and colony forming test were introduced to determine the sensibility of Bel-7402 to the different concentrations of rhGH (0， 1， 10， 100， 1 000， and 10 000 ng/mL). Growth rate of tumor cells was calculated. Metabolism of DNA of tumor cells was determined by the method of mixture of 3H-TdR. 【Results】 Radioligand assays showed GHR in Bel-7402 hepatic carcinoma cell strain. The rhGH had certain effects of the growth of 7402 hepatic carcinoma cell line. It showed positive effect to accelerate the proliferation on the growth of the hepatic carcinoma cells when the concentration of rhGH reached 100 ng/mL(P < 0.05，compared with control group). Although other rhGH concentrations (1， 10， 1 000， and 10 000 ng/mL)also had positive effects， they were much weaker than that at 100 ng/mL 24 hours after rhGH injection. 【Conclusion】 Certain concentrations of rhGH stimulated the growth of Bel-7402 hepatic carcinoma cell line in vitro in varying extent. The reason might be concerned with GHR expressed by 7402 hepatic carcinoma cell line.

　　Key words： growth hormone; growth hormone receptor; hepatocellular carcinoma; radiorecptor assay; cell culture

　　重组人生长激素(recombine human growth hormone，rhGH)在调节代谢、降低外科病人死亡率方面疗效卓著[1?鄄3]。然而rhGH能否用于肿瘤患者，目前存在较大争议[4]。动物实验发现，使用GH治疗具有潜在致癌性，超生理剂量GH能诱发各种恶性肿瘤[5]。

　　原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，由于肝脏是体内生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)存在最多的部位，为GH的主要靶器官[6]，因此在肝癌患者使用rhGH，其安全性更为临床所关注。1990年有学者于部分肝癌组织未检测到GHR，而认为在肝癌组织该受体消失[7]，其后临床普遍认为生长激素可安全适用于肝癌病人;近期虽随着方法学的改进，国内外学者陆续发现肝癌组织可表达低水平的GHR[4，8]，但对于肝癌的GHR是否存在功能、生长激素能否适用于肝癌患者远未达成共识[5]。

　　GH需要通过与其受体GHR结合方能发挥作用[6]，既往曾有学者发现生长激素对表达GHR 的HepG2肝癌细胞株的生长有促进作用[9]，但由于HepG2肝癌细胞株的病理来源于欧美人的小儿肝母细胞瘤[10]， 而我国的原发性肝癌则以肝细胞肝癌为主，其生物学特性与肝母细胞瘤存在较大差异。因此本研究的目的，旨在了解不同剂量rhGH 对病理来源于我国肝细胞肝癌的Bel?鄄7402肝癌细胞株(可表达GHR)增殖的影响，对rhGH在肝癌外科的适用性进行初步研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株与实验材料

　　人Bel?鄄7402肝癌细胞株购自中科学院上海细胞生物研究所，中山大学药学院动物中心保种;125I标记的人生长激素(125I?鄄hGH)，美国杜邦公司产品;人生长激素标准品，中国科学院上海细胞生物研究所基因工程组惠赠;人催乳素，美国Sigma公司产品;RPMI 1640培养液(美国Hyclon公司)，胎牛血清(美国GIBCO公司)，噻唑蓝(MTT)(美国Sigma公司)。重组人生长激素rhGH(思真，瑞士Serono公司惠赠)，3H?鄄TdR(中国原子能科学研究所生产，1.85 × 105 Bq/mL)，放射记数仪：上海日环工司产品。

　　1.2 观察指标与检测方法

　　1.2.1 细胞培养 Bel-7402肝癌细胞培养于含100 mL/L胎牛血清、青霉素及链霉素各100 个单位每mL的1640培养液中，37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱传代培养，实验设空白对照组、对照组和rhGH实验组，实验组加入rhGH，对照组仅加1640培养液，取细胞进行实验，每次实验重复3次。

　　1.2.2 rhGH作用下肝癌细胞生长曲线测定 将生长状态良好的细胞，以2.0 × 104个/mL浓度接种于24孔培养板(每孔1 mL)，随机分为6组(一组对照和五组实验组)，待细胞贴壁后分别于实验组中加入不同浓度的rhGH，使其在培养液中的浓度分别为1、10、100、1 000、10 000 ng/mL。在加药前每组各取6孔培养细胞经消化后计数作为细胞基数。加药以后连续培养4 d，每天从各组中取6孔细胞进行计数(每孔培养细胞重复计数3次，取平均值)，根据每组所得结果的平均值绘制不同浓度rhGH作用下肝癌细胞的生长曲线，计算各实验组肿瘤细胞的生长率：

　　生长率(%)=实验组的细胞数/对照组的细胞数 × 100%

　　1.2.3 噻唑蓝(MTT)比色法 肿瘤细胞稀释为2.0 × 104个/mL，以每孔200 μL接种于96孔培养板。每组设8个复孔，接种后24 h更换培养液，实验组加入含上述浓度rhGH的培养液。另设阴性对照和空白对照，阴性对照不加药，空白对照只加培养液无细胞。加药后分别于24、48、72、96 h加入20 μL MTT，孵育4 h后吸出上清，加入150 μL DMSO振荡溶解10 min，空白对照调零，用Bio-TEK酶联仪检测，波长490 nm，测定各孔的吸光值。

　　1.2.4 克隆形成实验 制备单细胞悬液，将肿瘤细胞分散为200个/mL接种于6孔培养板中，设实验组与对照组，每组4孔。各实验组分别加入上述不同浓度的rhGH，连续培养14 d，待细胞形成明显的集落后停止培养，洗掉培养液，Hank′s液洗两次，甲醛固定30 min， Giemsa液染色30 min。显微镜下计算集落数：以50个细胞以上者为一个集落，计数每孔集落数，取4孔集落数的平均值，计算集落形成率：

　　集落形成率(%) = 平均集落数/种入的单个细胞数 × 100%

　　1.2.5 3H-TdR掺入DNA法 调节肝癌细胞浓度为2.0 × 104/mL，接种于24孔细胞培养板中培养，24 h后换以含上述浓度rhGH的体积分数为10%的血清RPMI 1640培养液，测定DNA合成前18 h，每孔加3H-TdR 1.85 × 105 Bq/mL，胰蛋白酶和EDTA混合液消化，细胞全部悬浮后，用DYQ-Ⅱ型多头收集器将空内细胞收集于49型纤维滤纸上，红外线烤干，置微杯中，加闪烁液，用FJ2105全自动液闪计数器计数。实验进行两次，每次实验中每份样品六个复孔。以每分钟计数(counts per minute，cpm)/孔代表3H-TdR掺入DNA的量。

　　1.2.6 细胞放射受体分析 对照组肝癌细胞接种于培养瓶中，待细胞长满瓶底约75%左右时，胰酶消化，制成新鲜肝癌细胞悬液。将肝癌细胞悬液用无血清1640液洗3次，磷酸缓冲液重悬，细胞人工计数。放射受体反应的总体积为300 μL，其中125I-hGH 100 μL(约200 000 cpm/mL)，不同浓度的hGH 100 μL(0 ～ 3 nmol/L)分为7 ～ 9个浓度梯度)、肝癌细胞悬液100 μL(细胞密度 > 3.0 × 106/mL)，依此加入，振荡后4 ℃冰箱过夜。抽滤法去除游离配体，对沉淀物进行放射计数。实验设有复管。受体位点数(Site)和平衡解离常数(Kd)采用Scatchard法计算，每一数值重复测3次，结果用细胞数(106)校正。

　　1.3 统计方法

　　采用SPSS12.0统计处理软件，单因素方差分析(one way ANONA)对资料进行统计学处理，计量资料采用t检验或t′检验，以P < 0.05作为是否有统计学差别的指标。

　　2 结果

　　2.1 人7402肝癌细胞放射受体分析

　　人7402肝癌细胞的放射性配体分析数据经Scatchard转换后，Scatchard图呈直线图形，提示检测到单一的GH特异性结合位点(即GHR)，肝癌细胞GHR位点数量(Site，103/cell)为7.348 ± 0.891，平衡解离常数Kd为(0.630 ± 0.046)nmol/L。

　　2.2 各实验组和对照组在rhGH作用后24、48、72和96 h的肿瘤细胞计数

　　rhGH与7402肝癌细胞接触24 h后，除100 ng/mL组平均细胞计数的差别有显著性外，余4组与对照组之间无差别，而当时间延长到48 h，药物对肿瘤细胞生长的影响较为明显：10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL与10 000 ng/mL组在48h的细胞计数均高于对照组相比(P < 0.05)，但在72 h，只有100 ng/mL组与对照组相比有显著性(P < 0.05)，而在96 h，100 ng/mL、1 000 ng/mL与10 000 ng/mL组的细胞计数又明显高于对照组(P < 0.05，表1)。

　　2.3 rhGH对肿瘤细胞MTT显色活性的影响

　　rhGH与肝癌细胞接触24 h后，除100 ng/mL组与对照组相比有显著性外，余实验组与对照组之间无差别;而当接触时间延长，药物对肿瘤生长的影响也越明显，在48、72 h，除100 ng/mL组外，1 000 ng/mL与10 000 ng/mL组MTT值均高于对照组(P < 0.05)，在96 h，100 ng/mL组、100 ng/mL组、1 000 ng/mL的MTT值均高于对照组(P < 0.05，表2)。

　　2.4 rhGH对7402肝癌细胞集落形成率的影响

　　rhGH在1 000 ng/mL、 10 000 ng/mL 组集落形成率较对照组有所降低(P > 0.05)，但在10 ng/mL、100 ng/mL剂量组集落形成率较对照组明显升高(P < 0.05，表3)。

　　2.5 rhGH对7402肝癌细胞3H-TdR掺入量的影响

　　各实验组3H-TdR掺入量均较对照组有所增高，但只有100 ng/mL组与对照组相比有显著性(P < 0.05，表4)。

　　3 讨论

　　细胞的体外培养药物试验是药物研究的基本方法之一。既往虽有学者对rhGH与肝癌细胞株的生长关系进行了一定的研究工作[9，10]，但其所用HepG2肝癌细胞株来源于年轻白种人肝母细胞瘤标本，特性接近于肝细胞(不能分泌AFP，能分泌血浆蛋白：白蛋白、α2-巨球蛋白等，在免疫抑制小鼠中不致瘤，与人类正常肝实质细胞具有同源性)[9];而本研究所用的Bel-7402肝癌细胞株来源于一例国内老年男性原发性肝细胞癌患者，具有HCC细胞的恶性特征，能分泌AFP，异种动物移植可存活，生物学特性与临床肝癌细胞相似[11]。因此，对于了解 rhGH与肝癌细胞增殖的关系而言，本研究结果可能更具有代表性。

　　本研究采用了rhGH的6个等级浓度梯度来了解生长激素对体外培养的7402肝癌细胞生长的影响，其中10 ng/mL相当于正常人血GH的峰浓度[12]，100 ng/mL相当于4 ～ 10 U rhGH皮下注射后肝硬化患者血GH的峰浓度(即临床药理浓度)[13]。结果显示：与对照组相比，一定浓度下的rhGH对体外培养的7402肝癌细胞株的增殖具有不同程度促进作用，无论从细胞计数、MTT、3H-TdR掺入量，还是从集落形成等指标来看，均表现为rhGH在100 ng/mL的浓度时促进肝癌细胞的增殖较为显著;而rhGH在其它浓度时(1、 10、 1 000、 10 000 ng/mL)的细胞培养的部分时段，与对照组相比，对肝癌细胞的增殖也有一定程度的刺激作用(其中1 000、10 000 ng/mL组的作用又大于1、10 ng/mL组)，但作用效果总体上仍较rhGH 在100 ng/mL浓度时为弱，并且rhGH在高浓度组(1 000、10 000 ng/mL)，随着培养时间延长，还表现为对肿瘤细胞集落形成起一定抑制作用。由于rhGH只有通过与其受体结合才能发挥作用，本研究发现了7402肝癌细胞在蛋白与mRNA水平均存在GHR的表达，因此7402肝癌细胞表达GHR应为本研究中rhGH促进7402肝癌细胞增殖的主要原因，这也说明7402肝癌细胞的GHR具有一定功能。

　　既往研究发现，生长激素可以诱导或抑制自身受体的表达[14]。Barash等[15]报道采用无血清培养的大鼠肝细胞证实人hGH可以诱导GHR的表达，且具有量效关系。当hGH浓度大于10 ng/mL时，hGH可以诱导GHR;hGH浓度等于250 ng/mL时，诱导率最高;hGH浓度大于1 000 ng/mL时，hGH对GHR有抑制作用。hGH对GHR的诱导作用在加入hGH后48 h达到高峰，96 h后诱导作用减退。Nuoffer[16]在探测不同浓度(浓度分别为0、2、5、12.5、25、50和150 ng/mL)的20 Ku与22 Ku hGH对刺激肝癌细胞株HuH7 GHR和GHBp的表达规律时，发现生理浓度(包括了2、5、12.5、25、50 ng/mL)的20 Ku与22 Ku hGH能引起剂量依赖性的HuH7 GHR/GHBp的mRNA上调，而超生理剂量(150 ng/mL)的20 Ku hGH则会引起HuH7 GHR与GHBp mRNA的下调。在本研究中，不同浓度的rhGH促进7402肝癌细胞增殖效应不同，可能与生理及临床药理浓度(10与1 000 ng/mL的rhGH诱导7402肝癌细胞GHR的表达，而在高浓度(例如大于1 000 ng/mL)的rhGH作用下，rhGH可抑制肝癌细胞GHR的表达有关。

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