运用蛋白质组学技术研究结肠黏膜、腺瘤及腺癌组织蛋白的差异表达

　　作者：崔冀， 汪建平， 蔡世荣， 彭俊生， 黄奕华， 何裕隆， 骆衍新， 胡坤华 作者单位：中山大学 1. 附属第一医院胃肠胰外科， 2. 附属第六医院胃肠病学研究所//结直肠肛门外科，广东 广州 3. 中山医学院蛋白质组学研究中心， 广东 广州

　　【摘要】 【目的】 通过比较结肠正常黏膜、腺瘤、腺癌组织之间的蛋白质组表达差异，寻找结肠腺癌相关的蛋白质，筛选结肠癌早期诊断的分子标志物。 【方法】 运用比较蛋白质组学技术，对8例结肠癌患者(伴有腺瘤)的正常黏膜、腺瘤、腺癌组织提取的总蛋白进行双向电泳(2-D)，分析凝胶图片选择两两间差异表达超过2倍的蛋白质进行MALDI-TOF/TOF质谱分析和生物学信息分析。 【结果】 成功建立结肠正常粘膜、腺瘤、腺癌的双向凝胶电泳图谱，在凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为3 066、2 986和3 289，其中两两间表达差异超过2倍的斑点共有31个，质谱分析和数据库检索共鉴定出18种蛋白质，包括keratin 8、 S100A6、 protein disulfide isomerase等。从功能分析，这些差异蛋白与癌细胞的发生、增殖、分化、转移等相关。【结论】 比较蛋白质组学能较好地提示结肠腺癌与腺瘤及正常组织间的蛋白质表达差异，而对相关差异表达蛋白的研究有可能为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的分子靶向。

　　【关键词】 腺癌; 腺瘤; 结肠; 蛋白质组学

　　Identification of Differentially Expressed Proteins in Colonic Mucosa， Adenoma， and Adenocarcinoma by Proteomics

　　CUI Ji1， WANG Jian-ping2， CAI Shi-rong1， PENG Jun-sheng2， HUANG Yi-hua1， HE Yu-long1，

　　LUO Yan-xin2， HU Kun-hua3

　　( 1. Department of Gastrointestinal Surgery， The First Affiliated Hospital; 2. Digestive Surgery;

　　3. Protemics Research Center， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China )

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the cancer associated proteins and sensitive biomakers for early diagnosis of colon adenocarcinoma by using proteomic technique. 【Methods】 Two-dimensional gel electrophoresis was used to define patterns of protein expression in morphologically normal colonic mucosa from 8 subjects with adenocarcinoma and adenomatous polyps. Proteins expressed differently with a 2-fold change among groups which were cut and analyzed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. 【Results】 Two-dimensional protein maps of colonic mucosa， adenocarcinoma and adenoma were analyzed and gel-analysis software identified an average of 3 066 spots in normal tissue， 2 986 in adenoma tissue while 3 289 in adenocarcinoma and statistical filtering yielded 31 spots of a 2-fold change， 18 of which were identified by using mass spectrometry， including keratin 8， S100A6， protein disulfide isomerase， and so on. Functional analysis revealed that these proteins were associated with cellular oncogenesis， proliferation， differentiation， and metastasis. 【Conclusion】 Proteomic analysis can identify the proteins with variance of colon adenocarcinoma versus adenoma as well as providing probable new biomakers correlated with biological behavior of colon adenocarcinoma.

　　Key words： adenocarcinoma; adenoma; colon; proteomics

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2008，29(6)：744-748]

　　全世界每年有接近100万的结肠癌新发病例，并有接近50万人死于结肠癌。局限在肠壁内的结肠癌行根治性切除术后，5年生存率接近90%，但伴有淋巴结转移时，5年生存率下降至60%左右。故早期发现肿瘤是影响结肠癌治疗、预后的重要因素。为此，我们必须寻找更加精确、有效的分子标志物，以期早期发现肿瘤、对肿瘤进行个性化治疗从而改善患者的预后。而蛋白质组学技术在对实体瘤的分子标志物检测中显示出特有的高灵敏度、特异度。越来越多的研究采用这一技术对肿瘤相关的全部蛋白质进行研究，旨在从细胞水平和整体水平研究肿瘤蛋白质的组成及动态变化规律，从而深入认识个体的各种生理、病理过程，为疾病的诊治寻求高效的分子标志物。结直肠癌发生的“腺瘤-腺癌”病理过程已为众多学者接受[1]，腺瘤癌变率与年龄及腺瘤大小呈正相关，美国国家息肉研究组的资料证实切除腺瘤可减低癌发生率[2]。本研究以结肠正常黏膜组织、腺癌组织、腺瘤组织为研究对象，进行双向电泳和质谱分析，初步筛选结肠腺癌与正常黏膜组织、腺瘤组织中的差异蛋白。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　本实验中用于蛋白质组学研究的组织标本全部来自2004年7月至2006年7月间中山大学附属第一医院胃肠胰外科，结肠腺癌患者(伴有腺瘤样息肉)共8例，男女各4例，年龄29 ～ 76岁，平均年龄52.5岁，中位年龄51岁，术前均未进行放化疗，所有标本均经病理证实为结肠中分化腺癌，病理TMN分期Ⅰ ～ Ⅳ期各2例;所有腺瘤标本均一分为二，一份送病理证实为结肠管状腺瘤后，另外一份才进入实验;正常结肠黏膜取自经病理证实切缘阴性远侧肠管。实验所有样本收集后均立刻放入-80℃ 冰箱中。

　　固相pH梯度干胶条(IPG，pH 4～7，长度24 cm)、蛋白质纯化试剂盒(Clean up Kit)、蛋白质定量试剂盒(Quant Kit)、荧光染色试剂盒(Deep purple)均为GE公司产品;赖氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、尿素、二硫苏糖醇(DTT)、CHAPS、Tris、SDS均为GE产品;碘乙酰胺(IAA)、三氟乙酸(TFA)、基质(CHCA)均为GE公司产品;胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega公司。IPGphor II等电聚焦仪、DALT six垂直电泳系统、Typhoon 9400型凝胶成像系统、Image master分析软件、全自动凝胶斑点处理工作站(Spot handling workstation)为Amersham Biosciences公司产品;DU540型分光光度计(Beckman);4800型 MALDI-TOF/TOF质谱仪(ABI公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 组织蛋白的提取 取100 mg组织标本充分剪碎，分别加入细胞裂解液300 μL、PMSF(200 mmol/L) 0.9 ?滋L，低温下匀浆并进行超声波处理，然后20 000 × g、 4 ℃下离心30 min，离心结束后取上清液至新的EP管;按蛋白质纯化试剂盒说明书方法纯化蛋白后，对蛋白浓度进行定量。

　　1.2.3 双向凝胶电泳 将蛋白样品均匀加入等点聚焦(IEF)专用的胶条槽，放入IPG干胶条进行第一向电泳。IEF参数设置为：30 V， 12 h(胶条再水化); 500 V， 1 h; 1 kV，1 h; 8 kV， 30 min; 10 kV至总数为85 kV·h。IEF结束后，在平衡缓冲液中平衡胶条。将胶条转移至12.5%浓度的SDS-PAGE胶面上进行第二向电泳，参数设置为：2 W/胶，50 min后改为17 W/胶，直至电泳指示剂到达凝胶底部边缘。对凝胶按Deep purple说明书方法进行染色。

　　1.2.3 图象采集与分析 对进行图谱分析的凝胶，使用Typhoon 9400型凝胶成像系统成像，用Image Master图像分析软件进行图谱分析。凝胶图象经识别、分析后，寻找差异点，统计分析使用student t-test法。选取蛋白斑点表达差异大于2倍、t-test P < 0.05的斑点作为研究蛋白。

　　1.2.4 质谱图的获取 将染色的凝胶放入Spot handling workstation，进行自动化的蛋白质斑点切取、胰酶消化、萃取，样本手工除盐后在质谱靶上进行MALDI-TOF/TOF分析，获得肽质量指纹图谱(PMF)和5个最高离子峰的肽段MS/MS图谱。

　　1.2.5 质谱数据的分析 将质谱数据使用Mascot软件在NCBInr数据库中进行搜索，参数设置为：种属 Homo sapiens;肽段容忍度 75 ppm;离子碎片容忍度0.2 u;蛋白质检索得分大于95的认为是成功鉴定的蛋白质。

　　2 结 果

　　2.1 凝胶图象分析结果

　　2-D图谱结果发现3组蛋白表达斑点不同，且结肠腺癌组织和正常组织的蛋白斑点数均超过腺瘤组织(图1)。

　　2.2 图谱分析结果

　　结肠正常组织、腺癌组织和腺瘤组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质点数分别为3 066、 3 289和2 986;将其中一块胶设定为参考胶， 进行8个凝胶图谱斑点的匹配分析得到平均匹配率分别为85.6%和81.3%。进一步的重复性分析发现， 结肠腺癌组织和结肠腺瘤组织8个图谱中的蛋白质斑点在其位置上均有较好的重复性。根据蛋白质点表达量与所有匹配蛋白质点表达量总和的比值 > 3，且同组3块胶图谱中都出现相同变化的蛋白点， 被认为是差异蛋白质点。

　　2.3 质谱分析结果

　　在结肠腺癌组织和腺瘤组织的2-D图谱中， 选取两两间表达差异超过2倍的蛋白斑点31个，进行MALDI-TOF-MS/MS分析，得到蛋白质点的肽质量指纹图(PMF)，31个点共获取31张PMF，如Keratin 8的PMF图见图2。

　　2.4 蛋白质鉴定结果

　　应用PMF数据，通过Profound 查询软件搜索NCBInr数据库，进行蛋白质点的肽质量指纹谱与蛋白质数据库的比较来鉴定蛋白质。其中匹配分数大于63分的共有18个(表1)。

　　3 讨 论

　　尽管目前已经发现很多与结肠癌相关的基因，但结肠癌发生的精确机制仍然未知。控制细胞增值和分化的机制似乎受多种因素影响，如细胞表面粘附蛋白，趋化因子，细胞外基质蛋白，生长因子及其受体等。蛋白质作为发挥基因功能的载体，在疾病的发生、发展中有更直接的意义。故近年来，蛋白组学技术在结肠癌的发生、发展研究中显示出越来越重要的作用。

　　本研究共对8组结肠腺癌组织、腺瘤组织进行蛋白组学技术研究，共发现差异表达蛋白1 082个。选定31个进行质谱分析，最终鉴定出18种蛋白。这些表达有差异的蛋白是从结肠癌组织、腺瘤组织中比较分析而来，故可认为是结肠癌相关蛋白。

　　上皮细胞共有20种角蛋白( Cytokeratin， CK)，可分为两类，CKsⅠ(1 ～ 8)和CKsⅡ(9 ～ 20)。其中CK 1 ～ 6在立方上皮细胞表达，而胃肠道柱状上皮一般表达CK7，8，18 ～ 20[3]。本研究发现在结肠癌组织中CK8、CK10表达增加，这与现有的报道一致[4，5]，提示本研究结果有较好的重复性。CK8除维持正常细胞的结构外，尚担有上皮细胞生理的功能角色。缺乏CK8的老鼠能引起慢性结肠炎以及水电解质转运紊乱[6]，为细菌移位致病创造条件[7]，人体CK8突变可引起肠道上皮细胞抵抗力脆弱，可能在一些炎症性肠病中扮演重要角色[8]。可见，CK8可能在肠道黏膜上皮对抗致瘤性炎症刺激物中发挥作用[9]。

　　纤维蛋白原(Fibrinogen)在血液凝固中起作用。体外实验表明，Fibrinogen可促进前列腺癌和肺癌细胞中成纤维细胞生长因子(FGF)-2的增值作用[10]，而后者是正常组织和肿瘤组织增殖中重要的生长因子、并与肿瘤生长的血管增生密切相关[11]。另外，血液凝固在肿瘤转移相关的研究表明，肿瘤细胞停留在肺的毛细血管、并定植形成肺转移与纤维蛋白原、血小板组成的微血栓有关[12]。因此，Fibrinogen可能与结肠肿瘤的增殖、转移均有关。

　　S100是一类钙激活信号分子，与细胞的增殖、分化和细胞支架的动力有关。S100有多个亚型，其中S00A6是第一个鉴定出与细胞增殖有关的蛋白[13]。有研究表明，S100A6不同亚型的表达水平与结直肠肿瘤的发展明显相关[14]。本研究中结肠癌组织中S100A6表达明显比正常结肠组织中升高，除提示癌细胞增殖较正常组织旺盛外，尚可能与细胞分化水平及细胞动力相关的远处转移有关。

　　组织中蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)通常在应激情况下表达增加，在分泌型蛋白质的折叠中，与蛋白质的催化能力和二硫键的异构化有关。可以把PDI当作分子伴侣，表达增加提示细胞恶性化转变过程中的应激反应[15]。本研究中PDI在结肠癌组织中表达明显增加，可能提示细胞正在向恶性方向分化。

　　热休克蛋白 27 (heat shock protein 27， HSP 27) 低表达与胃癌[16]、卵巢癌[17]的发生相关，而高表达则与结直肠癌的转移相关[18]。另外，对化疗药Gemcitabine敏感和耐药的胰腺癌细胞进行比较蛋白组学研究发现，HSP 27与肿瘤细胞的耐药性明显相关;对耐药的胰腺癌细胞进行HSP 27基因敲除后，可以恢复细胞对Gemcitabine的敏感性[19]。本研究中发现HSP 27在结肠癌细胞中表达明显升高，提示HSP与肿瘤细胞的转移能力及化疗药耐药性相关。

　　蛋白质组学技术为研究肿瘤相关蛋白提供有效手段，本实验运用双向凝胶电泳和质谱技术，鉴定出与结肠癌相关的蛋白18个，这些蛋白可能跟结肠癌的发生发展、转移和细胞分化相关，可能成为结肠癌诊断、治疗的靶向性分子标志物，有助于早期发现、有效治疗结肠癌，从而改善结肠癌患者总体预后。

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