人乳腺癌细胞原代培养体外药敏试验及Her2、TopoⅡ的表达

　　作者：李艳兵1， 严 斌1， 石 岚2， 田 园2， 江 斌1* 作者单位：(1郧阳医学院附属太和医院普外科,湖北 十堰 442000;2武汉市协和医院乳甲外科，湖北 武汉 430022)

　　【摘要】 目的:研究4种化疗药物对原代培养人乳腺癌细胞的敏感性，结合Her2、TopoⅡ免疫组化表达结果，分析药敏结果与表达的相关性及临床意义。方法:利用CCK8法检测4种化疗药物对乳腺癌原代细胞生长的影响，免疫组织化学方法检测细胞中Her2、TopoⅡ的表达情况。结果:⑴4种化疗药物在不同浓度下对乳腺癌细胞的抑制率排序为：紫杉醇>长春瑞滨>阿霉素>卡铂，紫杉醇剂量与疗效之间有量效关系，而阿霉素、长春瑞滨和卡铂则不存在量效关系;⑵Her2、TopoⅡ阳性表达率分别为25.4%和53.9%;⑶紫杉醇、长春瑞滨、阿霉素对Her2阳性、TopoⅡ阳性细胞的生长有显著的抑制作用(P<0.05)，而卡铂则无显著性抑制作用。结论:原代培养肿瘤细胞的体外药敏试验对临床肿瘤的化疗有很强的指导作用,Her2、TopoⅡ可作为判断预后很好参考指标。

　　【关键词】 乳腺癌;原代培养;Her2;TopoⅡ

　　Chemosensitivity of Primary Cultured Human Breast Cancer Cells in Vitro and Its Expression of Her2 and TopoⅡ LI Yanbing1,YAN Bin1,SHI Lan2,TIAN Yuan2,JIANG Bin1* (Department of General Surgery,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;Department of Breast and Thyroid,Xiehe Hospital,Wuhan,Hubei 430022,China)

　　Abstract： Objective To investigate the chemosensitivity to four kinds of chemotherapeutic drugs in primary cultured human breast cancer cells,and to analyze the relationship between the sensitivity results and the expressions of Her2 ,TopoⅡ and its clinical siginificance based on the immunohistochemical results.Methods The effects of four kinds of chemotherapeutic drugs on primary cultured human breast cancer cells were detected with CCK8,the expressions of Her2 ,TopoⅡ were determined with immunohistochemical method.Results ⑴ The ranking of inhibitory effect of 4 drugs at different concentration was as follows:paclitaxel>vinorelbine>adriamycin>carboplatin,the inhibitory effct of paclitaxel was dosedependent,but there was no doseeffect relationship in vinorelbine,adriamycin and carboplatin;⑵the positive rates of Her2,TopoⅡ were 25.4% and 53.9%,respectively;⑶the growth of Her2,TopoⅡ positive cells were significantly inhibited with paclitaxel, doxorubicin, vinorelbine(P<0.05),while the inhibitory effect was not found in carboplatin.Conclusion The chemosensitivity study of primary cultured cancer cells may play important roles in selecting regimen of chemotherapy,Her2 and TopoⅡ could be sensitive indicators for judging prognosis.

　　Key words：Breast cancer;Primary culture;Her2;TopoⅡ

　　乳腺癌是女性高发的恶性肿瘤之一，发病率为10%～15%[1]，辅助化疗是乳腺癌综合治疗的重要组成部分。由于乳腺癌对化疗药物的敏感性存在个体差异，部分病人化疗效果较差，在治疗过程中根据体外肿瘤药敏试验结果，有针对性地使用敏感的药物，可一定程度上提高化疗的疗效及降低不良反应。同时由于乳腺癌的高复发和转移率，所以在指导乳腺癌化疗时，通过检测某些生物标记，能很好地判断预后。

　　1 资料和方法

　　1.1 临床资料

　　选取2007年5月-2009年1月63例于武汉协和医院行乳腺癌改良根治术女性患者的切除组织标本，患者的年龄35～70岁，其中45岁以下20例，45岁以上43例，左侧30例，右侧33例，伴同侧腋窝淋巴结转移的27例，无转移的36例;均为原发肿瘤，患者术前未接受放化疗，术后经病理证实为乳腺癌。

　　1.2 方法

　　1.2.1 乳腺癌细胞原代细胞培养:术中在无菌条件下获取患者的63例乳腺癌组织标本后，分为两部分，一部分行免疫组化备用，另一部分剪成大小约1～3 mm3，转入含胶原酶Ⅰ和Ⅳ的混合酶进行消化。获得单细胞悬液行乳腺癌细胞原代培养。

　　1.2.2 Cholecystokinin 8 (CCK8法)测定细胞对不同浓度下各种药物的敏感性:将制备好的细胞悬液接种到96孔板中, 每接种1×105个细胞，培养2 d后在显微镜下观察细胞状态，弃上清，加药。实验组的每个药物设5个不同浓度(0.2 PPC、0.5 PPC、1.0 PPC、1.5 PPC、2.0 PPC,PPC表示药物峰浓度),每个浓度设两个平行孔，阳性对照及空白对照各设两个复孔，并设空白对照组(不加药物) 和凋亡组(只加培养液)。将培养基在CO2培养箱中培养过夜，并向各孔加入10 μL CCK8溶液(批号：C0038)，继续培养,72 h后用CCK8法在标仪测定值,计算抑制率。

　　1.2.3 免疫组化:将多聚甲醛固定的乳腺癌组织标本经脱水、透明、浸润与包埋后制成石蜡包块，用石蜡切片机切片，切片厚度一般为4～8 μm，鼠抗TopoⅡ和Her2单克隆抗体和染色试剂盒(武汉博士德，批号：BA0015,MK115)，免疫组化具体步骤按提供的试剂盒说明书进行。标记TopoⅡ抗体的切片在染色前先作组织抗原微波修复。

　　1.3 结果判断

　　抑制率(inhibitory rate,IR)计算公式[2]:抗肿瘤药物对肿瘤细胞抑制率=1-加药实验组OD值/未加药对照组OD值×100%。Her2、TopoⅡ免疫组化结果判断[3]:Her2阳性物质分布于胞膜、胞浆中,TopoⅡ胞核出现棕黄色颗粒。根据肿瘤阳性细胞的百分率，大于15%为阳性，反之为阴性。

　　1.4 统计学处理

　　用SPSS 13.0软件包处理,采用卡方检验,P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 4种化疗药物对63例乳腺癌抑制率

　　见图1,4种化疗药物在不同浓度下对63例乳腺癌细胞检测的抑制率排序为：紫杉醇>长春瑞滨>阿霉素>卡铂。紫杉醇随着药物浓度的升高，抑制率增强,呈量效依赖关系(r=0.9947)，而阿霉素、长春瑞滨和卡铂不呈现量效依赖关系。

　　图1 4种药物不同浓度抑制率的比较(%)

　　2.2 Her2、TopoⅡ在癌组织中表达情况

　　见附图2～3,Her2、TopoⅡ在癌组织中表达：Her2和TopoⅡ的阳性率分别为25.4%(16/63)和53.9%(34/63)。

　　2.3 在1PPC峰浓下乳腺癌药敏实验抑制率与Her2、TopoⅡ的表达关系

　　见表1显示药敏试验结果抑制率与Her2、TopoⅡ 表达的关系，结果显示:对Her2阳性、TopoⅡ阳性的乳腺癌细胞,紫杉醇、长春瑞滨、阿霉素对细胞的生长有明显的抑制作用(P<0.05),而卡铂的作用无统计学意义。表1 体外药敏实验抑制率与Her2、TopoII表达的关系

　　3 讨论

　　部分乳腺癌患者术后化疗效果仍不理想，这可能与乳腺癌的多药耐药性(Multidrug resistance，MDR)及天然耐药性有关[4]，通常行体外药敏试验筛选合适的化疗药物，对提高化疗的效果，降低副反应发生率，减少化疗的耐药性有很重要的意义。

　　本次试验结果示：4种化疗药物在不同浓度下对63例乳腺癌细胞检测的抑制率排序为：紫杉醇>长春瑞滨>阿霉素>卡铂。通过观察临床疗效和药敏结果结合起来发现具有一定的指导意义,但还需要增加样本例数来增强体外敏感测试结果对临床化疗的指导性[5]。

　　目前对于乳腺癌预后仅凭淋巴结转移状况、原发肿瘤大小、组织学分级等这些指标做出的判断并不全面、准确，因此需要关联度及准确度更高的预后指标。Her2的状态也是常规预测预后的因子[6]。Her2/neu基因是由Her2/neu编码的185 kD的跨膜受体。只有20%～30%的过表达。乳腺癌Her2的过表达在临床病理特征上与乳腺癌的分级、 淋巴结转移呈正相关， 表达率越高， 预后越差[7]。本实验结果表明,Her2和TopoⅡ的阳性率分别为25.4%(16/63)和53.9%(34/63)。Her2高表达的患者对紫杉醇和蒽环类药物治疗敏感[8-9]，TopoⅡ表达与患者的预后有关， 大量研究表明Topo II高表达提示总生存期、无复发生存期(RFS)缩短[10-11]，是影响乳腺癌的疗效和预后的一项独立指标。

　　在Her2过度表达或扩增的乳腺癌患者中，蒽环类方案比非蒽环类治疗效果要好得多。这可能会Her2与拓扑异构酶II基因在17q染色体位置较近。据文献报道：对于Her2阳性的患者，含有高剂量蒽环类化疗方案的疗效比含有标准剂量蒽环类化疗方案疗效要好，并能预测并含有紫杉烷类与不含有紫杉烷类方案的疗效的差别。拓扑异构酶II是一个已知蒽环类抗生素作用的点[12]，最近的研究表明，删除和扩增基因的TopoⅡ提示着不良预后，同时又是预测含有蒽环类化疗方案比含有非蒽环类方案有效的指标。Her2/neu 基因是靶向治疗的药物如赫赛汀(曲妥珠单抗)治疗乳腺癌的作用靶点。Her2和TopoⅡ基因共同扩增的患者采用蒽环类加曲妥珠单抗联合治疗将会受益。

　　Her2 、TopoⅡ的表达可作为指导乳腺癌化疗的重要指标和判断乳腺癌预后的参考指标。对乳腺癌患者进行多项指标的综合检测, 是能更客观地反映患者预后,并为临床医师提供更科学的用药依据。

　　(文中图2～3见封二)

　　【参考文献】

　　[1]GonzalezAngulo AM,MoralesVasquez F,Hortobagyi GN.Overview of resistance to systemic therapy in patients with breast cancer[J].Adv Exp Med Biol,2007,608:1-22.

　　[2]赵秀芳，王金科，张晓丽，等.乳腺癌原代细胞培养及化疗药敏的研究[J].河北北方学院学报,2007，24(1):35-37.

　　[3]沈金辉,吴 璇,周厚强.乳腺癌细胞TopoⅡ与C2erbB22表达的相关性[J].国际检验学杂志,2007,28(07):600-601.

　　[4]Germano S,O'Driscoll L.Breast cancer:understanding sensitivity and resistance to chemotherapy and targeted therapies to aid in personalised medicine[J].Curr Cancer Drug Targets,2009,9(3):398-418.

　　[5]Ludwig JA.Personalized therapy of sarcomas: integration of biomarkers for improved diagnosis,prognosis,and therapy selection[J].Curr Oncol Rep,2008,10(4):329-337.

　　[6]Piccart M,Lohrisch C,Di Leo A,et al.The predictive value of HER2 in breast cancer[J].Oncology,2001,61(2):73-82.

　　[7]Lower EE,Glass E,Blau R,et al.Her2/neu expression in primary and metastatic breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2009,113(2):301-306.

　　[8]Shou J,Massarweh S,Osborne CK,et al.Mechanisms of tamoxifen resistance: increased estrogen receptorHER2/neu crosstalk in ER/HER2positive breast cancer[J].J Natl Cancer Inst,2004,96(12):926-935.

　　[9]Hamilton A,Larsimont D,Paridaens R,et al.A study of the value of p53,HER2 and Bcl2 in the prediction of response to doxorubicin and paclitaxel as single agents in metastatic breast cancer: A companion study to EORTC 10923[J].Clin Breast Cancer,2000,1(3):233-242.

　　[10]O′Malley FP,Chia S,Tu D,et al.Topoisomerase II alpha and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy?[J].J Natl Cancer Inst,2009,101(9):644-650.

　　[11]Hannemann J,Kristel P,van Tinteren H,et al.Molecular subtypes of breast cancer and amplification of topoisomerase II alpha:predictive role in dose intensive adjuvant chemotherapy[J].Br J Cancer,2006,95(10):1 334-1 334.

　　[12]Kathleen I,Pritchard,Hans Messersmith,et al.HER2 and Topoisomerase II as predictors of response to chemotherapy[J].Clin Oncol,2008,26(5):736-744