趋化因子受体CCR6在人肝癌组织中的表达及临床意义

　　作者：肖奋强, 狄茂军, 孙 勤, 戴全武 作者单位：(郧阳医学院附属太和医院普外2科，湖北 十堰 442000)

　　【摘要】 目的:探讨趋化因子受体CCR6在肝癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化方法检测30例肝癌组织及癌旁组织CCR6表达情况，探讨其与临床病理特征的关系。结果:⑴肝癌组织及癌旁肝组织中均可以检测到CCR6的表达,肝癌组织表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。⑵CCR6表达与病人性别、年龄、肿瘤大小、乙肝表面抗原、肿瘤分级及分期、肝硬化均无明显关系(P>0.05)，而与肿瘤是否有包膜，门静脉浸润显著相关(P<0.05)。⑶肝癌患者术后生存率与CCR6的表达相关，阳性组生存率低于阴性组。 结论:肝癌细胞表达CCR6趋化因子受体，其表达与门静脉浸润有关，有望成为判断肝癌侵袭性及预后的指标。

　　【关键词】 肝细胞癌;趋化因子受体CCR6;免疫组织化学;肿瘤浸润

　　Expression and Clinical Significance of Chemokine Receptor CCR6 in Human Hepatocellular Carcinoma XIAO Fenqiang，DI Maojun,SUN Qin,DAI Quanwu (The 2nd General Surgery Department,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To explore the expression of CCR6 in human hepatocellular carcinoma(HCC) and its significance.Methods The expression of chemokine receptor CCR6 in HCC and adjacent liver tissues were detected with immunohistochemical technique(SP) in 30 patients,and the relationship between the expression and the clinicopathological features was analyzed.Results ⑴The expression of CCR6 were detected in both HCC and adjacent tissues,the level of CCR6 in HCC tissue was significantly higher than that in adjacent liver tissues(P<0.05). ⑵The expression of CCR6 in HCC had no significant correlation with gender,age,tumor size, HbsAg,liver cirrhosis and TNM staging(P>0.05),while it was significantly correlated with tumor capsule and portal vein invasion(P<0.05).⑶The survival rate of postoperation was correlated with the expression of CCR6,and the survival rate of positive group was lower than that of negative group.Conclusion The expression of CCR6 in HCC may correlate with portal vein invasion,CCR6 may play an important role in prediction of invasiveness and prognosis in hepatocellular carcinoma.

　　Key words:Hepatocellular carcinoma;CCR6;Immunohistochemical;Invasiveness

　　肝细胞癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居我国恶性肿瘤第二位。趋化因子是一类分泌型小分子蛋白质，近来,越来越多的证据表明，其与肿瘤的侵袭转移密切相关[1-3]。本研究采用免疫组化方法检测CCR6趋化因子受体在人肝癌组织中表达情况，结合临床资料进行分析，了解其与临床病理特征的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集郧阳医学院附属太和医院2002-2004年手术切除的肝癌标本30例，每例分别取癌和癌旁组织(距肿瘤边缘>2 cm)，所有肿瘤标本经病理证实为肝细胞癌。30例患者中男性22例，女性8例;年龄27～76岁，平均46.1岁。按照Edmondson分级标准进行组织学分级，其中Ⅰ级及Ⅱ级8例，Ⅲ级12例，Ⅳ级10例，视Ⅰ及Ⅱ级为高分化，Ⅲ级及Ⅳ级为低分化。按2002年国际抗癌联盟(UICC)TNM标准进行分期：Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ期17例。肿块<5 cm者18例，≥5 cm者12例;包膜完整10例，包膜不完整20例;其中HbsAg阳性者7例，HbsAg阴性者23例;肝硬化者21例，无肝硬化者9例;12例无门静脉癌栓，18例有门静脉癌栓。

　　1.2 主要试剂

　　兔抗人CCR6受体抗体(BA0761)购自武汉博士德生物公司，免疫组化试剂盒(KIT9720)，生物素标记的第二抗体均购自福建迈新公司。

　　1.3 实验方法

　　所有标本经甲醛固定，常规石蜡包埋，厚4 μm连续切片，免疫组化SP法检测，具体步骤如下:石蜡切片经常规脱蜡、水化后，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次，每次3 min。柠檬酸缓冲液微波抗原修复。每张切片滴加1滴过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育10 min。PBS冲洗三次，每次3 min。甩去多余PBS液，滴加非免疫动物血清，室温下孵育10 min。甩去血清，滴加第一抗体(兔IgG)，置于湿盒内，室温下孵育60 min。PBS冲洗三次，每次5 min。甩去多余PBS液，滴加生物素标记的第二抗体，室温下孵育10 min。PBS冲洗三次，每次3 min。 甩去多余PBS液，滴加链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min。PBS冲洗三次，每次3 min。甩去多余PBS液，滴加DAB于显微镜下显色5～10 min后自来水漂洗。苏木素轻度复染3～10 s，切片脱水干燥，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

　　1.4 结果判定

　　由两位病理医师分别双盲阅片,按肿瘤细胞阳性细胞率和着色强度分别记分：⑴按阳性细胞百分率记分:0分为≤5%,1分为5%～25%,2分为25%～50%,3分为50%～75%,4分为≥75%;⑵按着色强度记分:0分为无着色,1 分为淡黄色,2分为黄色,3分为棕黄色。两者积分乘积为0表示阴性(-),大于1为阳性,其中1～2表示弱阳性(+),3～4表示阳性(++),≥5为强阳性(+++)。

　　1.5 统计学分析

　　应用SPSS 15.0统计学软件进行分析，免疫组化阳性率的比较用Fisher确切概率法，用 KaplanMeier法估计生存曲线，经对数秩检验，以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 CCR6趋化因子受体在肝癌组织和癌旁肝组织中的表达情况

　　CCR6趋化因子受体阳性表达主要定位肿瘤细胞膜及胞浆内，呈均匀的棕黄色颗粒状染色(见图1)。本研究结果显示CCR6在肝癌组织的阳性表达高于癌旁肝组织，其阳性率分别为60.0%(18/30)及26.7%(8/30)，差异有显著性(P<0.05)。

　　2.2 肝癌组织CCR6趋化因子受体表达与临床病理特征的关系

　　CCR6表达与临床病理特征的关系见表1。结果显示CCR6表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、乙肝表面抗原、肿瘤分级及分期、肝硬化均无明显相关性(P>0.05)，而与肿瘤是否有包膜，门静脉浸润显著相关(P<0.05)。表1 CCR6表达与肝癌临床病理特征的关系

　　2.3 CCR6在肝细胞癌的表达与术后肝癌患者预后的关系

　　根据CCR6的表达将肝癌术后患者分为阳性组和阴性组，经随访资料分析，阳性组术后一年、三年、五年生存率分别为55.6%、16.7%、0;阴性组术后一年、三年、五年生存率分别为83.3%、41.7%、16.7%。用KaplanMeier法估计生存曲线，经对数秩检验有统计学意义(P<0.05)，说明肝癌患者术后生存率与肝癌组织中CCR6的表达有关，CCR6阴性表达组生存率明显高于阳性表达组。

　　3 讨论

　　趋化因子是一类细胞因子样的具有趋化作用的分泌型小分子蛋白质(8～10 kD)，通过与靶细胞膜上相应的趋化因子受体结合发挥作用。趋化因子受体属G蛋白偶联的7次跨膜受体超家族，其N末端与配体结合，胞内区与 G蛋白偶联，C末端含丝氨酸/苏氨酸，可磷酸化，参与信号传导。趋化因子与其受体结合后在调节白细胞定向移动、细胞生长、发育、分化、凋亡、组织损伤、淋巴细胞归巢、免疫应答、HIV感染和血管生成等众多生理、病理过程中起着非常重要的作用[4-5]。近来，越来越多的证据表明，趋化因子与肿瘤的侵袭、转移密切相关[6]。目前趋化因子及受体在肝癌侵袭转移中的作用研究甚少。本研究采用免疫组化方法检测了CCR6趋化因子受体在人肝癌组织及其癌旁组织中的表达情况，结果显示CCR6在肝癌组织及其癌旁组织中均有表达,肝癌组织中CCR6表达水平明显高于癌旁肝组织。推测，CCR6的表达可能和肝细胞癌的发生发展有关，与Fujii及Masai报道一致[7-8]。Fujii等[7]采用RTPCR方法研究发现，人肝癌细胞株HuH7高表达趋化因子受体CCR6，且在人肝癌组织中亦有CCR6表达。Masai等[8]报告肝癌细胞株表达CCR6趋化因子受体。但均未对CCR6的临床意义及其在肝癌侵袭转移中作用进一步研究。

　　对CCR6趋化因子受体表达水平与肝癌临床病理特征的关系进行统计学分析显示：CCR6趋化因子受体表达水平与病人性别、年龄、肿瘤大小、是否携带乙肝表面抗原、肿瘤分级及分期、有无肝硬化均无明显相关性，而与肿瘤是否有包膜，门静脉浸润显著相关。肿瘤无包膜者表达水平高于有包膜者，有门静脉浸润者表达水平高于无门静脉浸润者。有完整包膜的肝癌组织中，CCR6趋化因子受体阳性表达率为30.0%，而无包膜的肝癌组织中，阳性表达率为65.0%，差异有显著性。有门静脉浸润的肝癌组织中，CCR6趋化因子受体阳性表达率为83.3%，而无门静脉浸润的肝癌组织中，阳性表达率为25.0%，差异有显著性。门静脉浸润、肿瘤包膜不完整均被视为肝癌高侵袭性的标志及术后复发转移的危险因素，提示其在肝癌侵袭转移尤其是门静脉浸润过程中可能起重要作用。术后随访资料表明CCR6阳性表达组生存率明显低于阴性表达组(P<0.05)。CCR6阳性高表达可能是肝癌患者预后不良的重要标志，检测CCR6趋化因子受体有望成为判断肝癌侵袭性及预后的指标。

　　(文中图1见封二)

　　【参考文献】

　　[1]Proudfoot AE.Chemokine receptors:multifaceted therapeutic targets[J].Nat Rev Immunol,2002,2(2):106-115.

　　[2]Murphy PM.Chemokines and the molecular basis of cancer metastasis[J].N Engl J Med,2001,345(11):833-835.

　　[3]Balkwill F.Chemokine biology in cancer[J].Semin Immunol,2003,15(1):49-55.

　　[4]Rossi D,Zlotnik A.The biology of chemokines and their receptors[J].Annu Rev Immunol，2000，18：217-242.

　　[5]Schwarz MK，Wells TN.New therapeutics that modulate chemokine networks[J].Nat Rev Drug Discov,2002，1(5)：347-358.

　　[6]Balkwill F.Chemokine biology in cancer[J].Semin Immunol，2003，15(1)：49-55.

　　[7]Fujii H,Itoh Y,Yamaguchi K,et al.Chemokine CCL20 enhances the growth of HuH7 cells via phosphorylation of p44/42 MAPK in vitro[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,322(3):1 052-1 058.

　　[8]Masai K,Iwashita Y,Tominaga M,et al.mRNA expression of chemokine receptors in hepatic and pancreatic tumor cell lines[J].Gan To Kagaku Ryoho,2004,31(8):1 261-1 263