大蒜素对神经母细胞瘤生长的抑制作用

　　作者：曾纪晓， 孙俊杰， 莫家骢， 马 毅， 何晓顺 作者单位：1. 广州市儿童医院普通外科， 广东 广州 510120; 2. 中山大学附属第一医院小儿外科， 广东 广州 510080;3. 中山大学附属第一医院器官移植科， 广东 广州 510080

　　【摘要】 【目的】 探讨大蒜素对神经母细胞瘤生长的影响及相关机制。【方法】 MTT法测定不同浓度大蒜素对神经母细胞瘤细胞生长的影响;建立裸鼠人神经母细胞瘤皮下移植瘤模型24只(n = 8)，随机分为对照组、大蒜素Ⅰ组(1 mg·kg-1·d-1)和大蒜素Ⅱ组(10 mg·kg-1·d-1)，观察其对肿瘤生长的影响，荧光定量PCR法测定大蒜素对裸鼠皮下移植瘤VEGF mRNA表达的影响;ELISA法测定裸鼠血浆VEGF浓度;免疫组化法观察肿瘤微血管密度。【结果】 不同浓度的大蒜素均能抑制神经母细胞瘤细胞的生长，高浓度的大蒜素能直接杀死肿瘤细胞;大剂量和小剂量大蒜素对裸鼠神经母细胞瘤皮下移植瘤均有抑制作用。对照组、大蒜素Ⅰ组和Ⅱ组的肿瘤体积为(2143 ± 127) mm3、(1041 ± 89) mm3和(904 ± 65) mm3 (P < 0.05);大蒜素能下调神经母细胞瘤VEGF mRNA转录，对照组、大蒜素Ⅰ组和Ⅱ组VEGF mRNA表达量分别为(8.4 ± 0.8)、(6.1 ± 0.7)和(5.1 ± 0.5);大蒜素能够抑制肿瘤细胞VEGF的表达，对照组、大蒜素Ⅰ组和Ⅱ组裸鼠血VEGF浓度分别为(78 ± 10)、(45 ± 8)和(35 ± 7) pg/mL;大蒜素可以减少神经母细胞瘤的微血管密度。【结论】 大蒜素在体内和体外均可抑制神经母细胞瘤细胞的生长，其机制与大蒜素抑制肿瘤细胞增殖和下调神经母细胞瘤VEGF mRNA的转录和蛋白表达有关。

　　【关键词】 大蒜素; 肿瘤; 神经母细胞瘤; 血管内皮生长因子

　　Inhibition of Allicin on Growth of Neuroblastoma in Vitro and in Vivo

　　ZENG Ji-xiao1， SUN Jun-jie2， MO Jia-cong2， MA Yi3， HE Xiao-shun3

　　(1. Department of General Surgery， Guangzhou Children's Hospital， Guangzhou 510120， China;

　　2. Department of Pediatric Surgery， The First Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China;

　　3. Department of Organ Transplantation， The First Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the efficacy and the possible mechanism of neuroblastoma induced by allicin. 【Methods】 MTT assay was used to test the effect of allicin on the growth of human neuroblastoma cell lines SK-N-SH. Twenty four nude mice bearing subcutaneous xenograft human neuroblastoma (NB) were randomly divided into 3 groups： the control group， the allicin group Ⅰ (allicin 1 mg/kg/d) and group Ⅱ (allicin 10 mg/kg/d). The role of allicin on the growth of the tumor was evaluated after 4 weeks， including the tumor volume and weight. The expression of VEGF mRNA was detected by fluorescent quantitation ploymerase chain reaction (FQ-PCR). The serum VEGF concentration was measured by ELISA. The expression of MVD was analyzed with immunocytochemistry. 【Results】 Allicin inhibited the growth of NB in vitro and in vivo. The volume of tumor： the control group (2143 ± 127) mm3， allicin group I (1041 ± 89) mm3 and allicin group II (904 ± 65) mm3 (P < 0.05). The expression of VEGFmRNA and serum VEGF concentration was inhibited significantly by allicin. The expression of VEGF mRNA in the control group， the allicin group I and allicin group II was (8.4 ± 0.8)， (6.1 ± 0.7)， and (5.1 ± 0.5)(P < 0.05). The serum VEGF concentration in the control group， the allicin group I and allicin group II was (78 ± 10)， (45 ± 8) and (35 ± 7) pg/mL(P < 0.05). Allicin inhibit the expression of MVD of NB (P < 0.05). 【Conclusion】 Allicin can inhibit the growth of NB in vitro and in vivo， which may be caused by suppression the expression of VEGF and MVD.

　　Key words： allicin; neoplasm; neuroblastoma; vascular endothelial growth factor

　　神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是小儿常见的恶性肿瘤，术前多需化疗，术后应予常规化疗，但化疗过程中小儿对使用的化疗药物反应较大，且有部分患儿对抗肿瘤药物不敏感，甚至呈多药耐药[1-3]。有必要筛选对神经母细胞瘤有效的其他药物，研究表明大蒜素对胃癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等均有明显抑制作用[4-7]。大蒜素对神经母细胞瘤的作用目前未见报道，本研究旨在研究大蒜素对神经母细胞瘤生长的影响，并探讨可能的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料

　　人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH由国家重点学科中山大学普通外科实验室传代保种。BALB/C，nu/nu裸鼠，鼠龄4周，体质量18 ～ 20 g，由中山大学动物实验中心提供，动物合格证号2004A084。无特殊病原菌(SPF)条件下分笼饲养。大蒜素(上海禾丰制药公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma公司)，小鼠抗人VEGF ELISA试剂盒(武汉博士德，中国)，CD34单克隆抗体(Antibody Diagnostical Inc， USA)，Trizol RNA提取试剂盒(Inritrogen，USA)，Bio-Rad450酶标仪(Coulter， USA)，流式细胞仪(Coulter， USA)，引物和探针由上海博亚生物公司合成。

　　1.2 细胞培养和MTT法测定大蒜素对NB细胞株SK-N-SH生长的影响

　　人NB细胞SK-N-SH常规复苏、传代，高糖DMEM培养基和100 mL/L胎牛血清，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。倒置相差显微镜下观察细胞生长的情况及大蒜素对细胞形态的影响。取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5 × 104/mL接种于96孔板，每孔接种200 μL，培养24 h后加入大蒜素，使其终浓度分别为10、20、40、400、4 000 μg/L，对照组仅加入培养液;96孔板置于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱内分别培养24、48、72 h，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL，37 ℃培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，检测前轻轻振荡培养板15 ～ 20 min，使结晶充分溶解，用酶标仪在450 nm处测定每孔吸光度(A)值，并用630 nm作为参考波长。每次、每一浓度、每时段条件做6个平行孔，重复3次。

　　1.3 建立裸鼠人神经母细胞瘤皮下移植瘤模型、实验分组和处理方案

　　参照文献[8]的方法，每只裸鼠接种1 × 107个细胞，建立该模型24只，将成模裸鼠随机分为3组(n = 8)：空白对照组;大蒜素Ⅰ组：大蒜素每日按体质量1 mg/kg;大蒜素Ⅱ组：大蒜素每日10 mg/kg。裸鼠成瘤后1周开始给药，每4 d测定裸鼠质量、皮下移植瘤体积，腹腔内注射给药4周后处死裸鼠。完整剥除肿瘤，测定肿瘤体积及重量，肿瘤分为2份，于液氮冻存及制备石蜡标本。

　　1.4 荧光定量PCR检测裸鼠皮下移植瘤VEGF mRNA表达

　　引物和探针：VEGF F： 5′-GCGAGGCCACGGC TTAT-3′，VEGF R：5′-TGAGTTGAGGTTGGCCTGT TC-3′， GAPDH F： 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC -3′，GAPDH R： 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，VEGFC Probe： 5′ FAM-AAGCAAAGATCTGGA GGAGCAGT-TAMARA-3′，GAPDH Probe： 5′ FAM- CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3′。 逆转录反应条件：93 ℃ 3 min预变性，93 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。反应后取8 μL PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。阳性定量模板(GAPDH)按倍比稀释而成。扩增反应条件为：93 ℃ 2 min，93 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。

　　1.5 ELISA法测定裸鼠血浆VEGF浓度

　　采用右眼球摘除法处死裸鼠，无菌EP管收集血液标本，一般为1.5 ～ 1.8 mL，常温下静置30 min，4 000 r/min离心5 min，收集上清放-70 ℃超低温冰箱保存待测，按ELISA试剂盒操作流程测定血浆VEGF浓度。

　　1.6 免疫组化法测定裸鼠皮下移植瘤微血管密度

　　采用CD34二步免疫组化法(SP法)，按试剂说明书操作。先于100倍光镜寻找肿瘤中心微血管密度最高的3个区域，后在400倍镜下计算肿瘤微血管数目的均值。计数包括黄染的内皮细胞，与邻近微血管肿瘤细胞之间有明显分离的内皮细胞团，但将管腔 > 8个红细胞面积的血管排除在外。微血管密度(MVD)为平均微血管数目/0.216，本过程按盲法操作。

　　1.7 统计学方法

　　数据用均数±标准差(x ± s)表示，采用t检验和方差分析。采用SPSS 11.0软件包，取?琢 = 0.05。

　　2 结 果

　　2.1 倒置相差显微镜下SK-N-SH细胞形态观察

　　正常生长的SK-N-SH 细胞呈梭形或多角形，有较长的突起，呈单层贴壁，生长迅速，代谢旺盛，48 h须换液一次，3 ～ 4 d传代1次。对照组细胞大小、形态不规则，但差异不大，折光性好，边缘清晰，内含丰富颗粒。药物处理组12 h后细胞大小、形态和贴壁能力较对照组有明显差别：低浓度大蒜素组(10、20 μg/L)作用后，细胞形态变化不大，贴壁尚可;较高浓度大蒜素组(40 μg/L)作用后，细胞明显皱缩，突起少见，细胞间隙增大，细胞内颗粒颜色加深，折光性增强，大量细胞呈片状脱落，培养液中有多量细胞漂浮，细胞生长明显减缓。处理24 h后上述变化更加明显。高浓度大蒜素组(400、4 000 μg/L)作用12 h后，绝大部分肿瘤细胞死亡(图1A、B)。

　　2.2 大蒜素对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞生长的影响

　　MTT 法结果显示不同浓度的大蒜素对人神经母细胞均有抑制作用，与对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.05);高浓度的大蒜素可直接杀死神经母细胞(表1)。

　　2.3 裸鼠皮下移植瘤成瘤率及大蒜素的影响

　　24只裸鼠全部成瘤，成瘤率100%。SK-N-SH细胞接种后1周左右成瘤。各组裸鼠实验期间，精神、反应和饮食正常，实验结束时，24只裸鼠均存活，无裸鼠死亡退出实验，对照组裸鼠肿瘤表面有明显出血和坏死，血管丰富。与对照组比较，不同剂量的大蒜素能明显抑制皮下移植瘤的生长，肿瘤的重量和体积差异有统计学意义(P < 0.05);小剂量组与大剂量组间比较，差异有统计学意义(P < 0.05;表2，图2)。

　　2.4 大蒜素对裸鼠人神经母细胞瘤VEGF mRNA转录和翻译的影响

　　与对照组比较，不同剂量的大蒜素均明显抑制肿瘤VEGF mRNA的转录，抑制肿瘤VEGF的分泌(P < 0.05)，不同浓度组间比较差异有统计学意义(P < 0.05，表2)。

　　2.5 大蒜素对裸鼠人神经母细胞瘤皮下移植瘤MVD的影响

　　与对照组比较，不同剂量的大蒜素均明显减少神经母细胞瘤MVD(P < 0.05)，且不同浓度组间比较差异有统计学意义(P < 0.05，表2)。

　　3 讨 论

　　神经母细胞瘤(NB)为小儿最常见的颅外实体肿瘤，其恶性程度高，早期即可发生多部位、多系统转移，手术切除率低[1]。NB对常规放射和化学治疗不甚敏感，患儿的预后不理想，其发病率和病死率居儿童肿瘤前列，严重威胁广大儿童的生命健康[1]。有必要寻求一种新的、安全有效的NB治疗药物，以期改善NB的治疗效果和预后。目前关于大蒜素和NB关系的研究尚未见报道，我们选取大蒜素为研究药物，采用体外细胞培养和裸鼠实验的方法，观察大蒜素对SK-N-SH细胞生长的影响，并探讨其在细胞、蛋白、基因等多个水平上可能的作用机制，以期为NB的防治做一有益的探索。

　　大蒜素为大蒜鳞茎中提取的特有的含硫化合物，近年国内外的流行病学调查和实验表明，大蒜素对多种恶性肿瘤有抑制作用[5-8]。本实验证实，不同浓度的大蒜素对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞形态和细胞增殖有明显影响，10 μg/L大蒜素即可抑制SK-N-SH细胞增殖，并且这种抑制作用，随药物浓度的增加而加强，400 μg /L以上大蒜素作用48 h可直接杀死肿瘤细胞。

　　在进一步的裸鼠实验中我们发现，不同剂量的大蒜素均能抑制裸鼠人神经母细胞瘤皮下移植瘤的生长，大蒜素处理后的裸鼠皮下移植瘤的体积和质量明显小于对照组，呈剂量-效应关系。肿瘤的生长必须依赖血管形成，在缺乏血管新生的条件下肿瘤仅能生长2 ～ 3 mm。VEGF是目前所知作用最强的促血管生长因子，诱导内皮细胞有丝分裂，增加血管通透性，抑制肿瘤细胞的凋亡，并能通过诱导巨噬细胞释放血管生长因子，间接促进血管生成。VEGF对肿瘤的生长、浸润和转移均发挥重要的调节作用，与肿瘤的临床分期呈正相关关系[9]。实验证实NB皮下移植瘤中VEGF呈高表达[10]，NB患者肿瘤组织的VEGF mRNA亦呈高表达，肿瘤组织表达VEGF的高低与肿瘤分级有关[11]。本实验中我们运用荧光定量PCR和ELISA的方法，定量检测裸鼠皮下NB的VEGF mRNA的转录量和血清VEGF的浓度，证实运用大蒜素后能够下调NB的转录和翻译，从而抑制NB生长。

　　肿瘤的生长、转移和新生血管的数量有密切关系，NB中VEGF和MVD均呈高表达[12]，VEGF与肿瘤内MVD呈正相关关系[9]。有学者认为MVD是评价肿瘤组织内血管生成状态以及判断患者预后的金标准[13]。本实验运用CD34单克隆抗体及盲法计算裸鼠皮下移植瘤标本的MVD，结果提示大蒜素可以降低人神经母细胞瘤移植瘤的MVD，显示出具有抗肿瘤血管生成的作用。该结果与肿瘤VEGF mRNA 的定量分析和外周血VEGF浓度测定结果一致。

　　上述研究表明，大蒜素对神经母细胞瘤有明显的抑制作用，作用靶点为抑制肿瘤VEGF的表达，为我们治疗NB 提供了一个新的可能，但要想使其真正应用于临床并使NB 患儿受益，还需要开展更广泛更深入的研究。

　　【参考文献】

　　[1]檀卫平，见须英雄，马渊理. 神经母细胞瘤60例预后因素分析 [J]. 中山大学学报：医学科学版， 2003，24(1)：92-96.

　　[2]郑 磊，孙晓非，甄子俊，等. 神经母细胞瘤患者血清神经元特异性烯醇化酶水平变化的临床意义——附50例报告 [J]. 新医学， 2008，39(10)：644-646.

　　[3]朱明亮，朱云发. 颅鼻沟通嗅神经母细胞瘤1例及文献复习 [J]. 中华神经医学杂志， 2003，2(3)：229-230.

　　[4]Kwon KB， Yoo SJ， Ryu DG， et al. Induction of apoptosis by diallyl disulfide through activation of caspase-3 in human leukemia HL-60 cells [J]. Biochem Pharmacol， 2002，63(1)：41-47.

　　[5]Gunadharin DN， Arunkumar A， Krishnamoorthy G， et al. Antiproliferative effect of diallyl disulfide (DADS) on prostate cancer cell line LNCaP[J]. Cell Bioche Funct， 2006，24(5)：407-412.

　　[6]Nakagawa H， Tsuta K， Kiuchi K， et al. Growth inhibitory effects of diallys disulfide on human breast cancer cell lines [J]. Carcino genesis， 2001，22(6)：891-897.

　　[7]Wen J， Zhang Y， Chen X， et al. Enhancement of diallyl disulfide-induced apoptosis by inhibitors of MAPKs in human HepG2 cells[J]. Biochem Pharmacol， 2004，68(2)：323-331.

　　[8]曾纪晓，何晓顺，马 毅. 雷帕霉素对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用 [J]. 中华实验外科杂志， 2007，24(12)：1522-1524.

　　[9]白守民，刘宜敏，薛卫平，等. 鼻咽癌组织中VEGF表达及MVD的临床意义 [J]. 中山大学学报：医学科学版， 2004，25(3S)：69-70.

　　[10]Kaneko S， Ishibashi M， Kaneko M. Vascular endothelial growth factor expression is closely related to irinotecan-mediated inhibition of tumor growth and angiogenesis in neuroblastoma xenografts[J]. Cancer Sci， 2008，99(6)：1209-1217.

　　[11]Langer I ， Vertongen P， Perret J， et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptors in human neuroblastomas [J]. Med Pediatr Oncol， 2000，34(6)：386-393.

　　[12]邹勇根，孙俊杰，莫家骢. 化疗对小儿神经母细胞瘤的VEGF 表达的影响 [J]. 中华小儿外科杂志， 2005，26(10)：523-525.

　　[13]O，Reilly MS， Boehm T， Shing Y， et al. Endostatin： an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth [J]. Cell， 1997，88(2)：277-285.