金雀异黄素诱导人肝癌细胞SMMC7721细胞凋亡的研究

　　作者：王宝海 田晓丰 曹宏 作者单位：辽源市矿务局总院普外科，吉林 辽源 136201　1 吉林大学中日联谊医院腹腔镜外科　2 吉林大学第二临床医院普外科

　　【摘要】目的 探讨金雀异黄素(Genistein，Gen)对人肝癌SMMC7721细胞凋亡调控的作用。方法 将Gen分为5.0、10.0、20.0 μg/ml 三个浓度处理组和对照组(未加金雀异黄素)，作用SMMC7721细胞不同时间后，透射电镜观察细胞超微结构变化;免疫组化法检测细胞内Bax、Bcl2蛋白的表达水平。结果 与对照组比较，Gen处理组可使细胞核内异染色质呈块状凝集、胞质内线粒体肿胀空化，随着作用浓度增加，细胞核呈固缩状，核内异染色质趋边凝集，细胞质空化明显;免疫组化显示，随着Gen浓度增加，Bax蛋白表达增强，Bcl2蛋白表达减弱，并呈剂量依赖性(P<0.01)。结论 金雀异黄素可以诱导人肝癌SMMC7721细胞凋亡。上调Bax蛋白表达，下调Bcl2蛋白表达可能是其诱导细胞凋亡的作用机制。

　　【关键词】 金雀异黄素 肝癌 凋亡

　　金雀异黄素(Genistein，Gen)是存在大豆中的异黄酮成分，以往研究表明，Gen对雌激素相关性肿瘤(人乳腺癌、前列腺癌细胞株)的生长有明显抑制作用〔1～3〕。近年研究报道，Gen对非雌激素依赖性肿瘤(大肠癌、肺癌等)也有抑制作用〔4，5〕，但目前关于Gen对人肝癌细胞的作用报道较少。本研究采用体外细胞培养技术观察Gen对人肝癌SMMC7721细胞凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人肝癌细胞株SMMC7721由吉林大学基础医学院提供。Gen、MTT、胰酶均购自美国Sigma公司，Gen纯度为98%，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成4 mg/ml的储备液-20℃保存，用时将培养液稀释成所需浓度。DMSO在各组培养液中终浓度均为0.1%。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，小牛血清购自四季青公司，余为国产分析纯。鼠抗人Bax、Bcl2蛋白单克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品。

　　1.2 细胞培养

　　将传代的SMMC7721细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液的25 ml培养瓶中，接种浓度为106/ml，置于含5%CO2、37℃培养箱中培养24 h后，分别加入0、5、10、20 μg/mlGen继续培养24、48 h。

　　1.3 电镜观察

　　收集Gen终浓度为0、5.0、10.0、20.0 μg/ml处理的SMMC7721细胞，用预冷PBS清洗3次，1 500 r/min离心10 min，沉淀于尖底0.5 ml EP管，4%戊二醛固定2 h。磷酸缓冲液冲洗3h，1%锇酸固定，系列乙醇脱水，乙醇、丙酮脱水。Epon812环氧树脂包埋，LKBⅢ型超薄切片机1～2 μm半薄切片定位后作50～70 nm超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色各10 min，JEM1200EX型透射电子显微镜观察。

　　1.4 Bax、Bcl2蛋白水平的检测

　　采用免疫组化SP法。各浓度Gen加入对数生长期的SMMC7721细胞，孵育48 h后，丙酮固定，正常血清封闭后分别加入鼠抗人Bax、Bcl2单克隆抗体，随后加入生物素标记的二抗及SP液，经DAB显色。以PBS代替一抗作为阴性对照。光学显微镜下Bax、Bcl2表达阳性细胞的胞浆内呈现特异性棕褐色，阳性表达率=(500个细胞内阳性细胞数/500)×100%。

　　1.5 统计学方法

　　数据用x±s表示，应用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 Gen对SMMC7721细胞超微结构的影响

　　见图1。正常细胞核呈圆形，核仁明显，核内染色质分布均匀，胞质内较多糖原颗粒。Gen浓度5 μg/ml时作用细胞后细胞核内异染色质呈块状凝集，胞质内线粒体肿胀空化，胞质基质轻度空化。Gen10.0 μg/ml作用细胞后细胞呈固缩状改变，核膜不清晰。Gen20.0 μg/ml作用细胞后细胞核呈固缩状，核内异染色质趋边凝聚，细胞质空化明显。

　　2.2 Gen对Bax、Bcl2蛋白表达的影响

　　不同浓度Gen作用48 h后，SMMC7721细胞中Bax蛋白表达上调，Bcl2蛋白表达下降。对照组与金雀异黄素5.0、10.0和20.0 μg/ml组Bax蛋白表达率分别为(12.03±0.38)%、(14.27±1.65)%、(20.10±1.37)%、(26.93±1.99)%;Bcl2蛋白表达率分别为(31.33±4.17)%、(23.93±3.37)%、(18.17±1.33)%、(10.10±1.42)%。随着浓度增加，Bax蛋白表达率逐渐升高，Bcl2蛋白表达率逐渐下降。金雀异黄素各组Bax、Bcl2蛋白表达率与对照组比较差异均有显著性(P<0.01)。图1 肝癌细胞超微结构(×1 000)

　　3 讨 论

　　Gen是存在于植物中的天然异黄酮类物质，其化学名为4′，5，7三羟基异黄酮，具有多种生物学作用，其抗癌活性已引起广泛关注。研究显示，Gen对多种肿瘤均有抑制作用〔6～8〕。本研究表明，Gen能诱导SMMC7721细胞凋亡，抑制SMMC7721细胞增殖，并且20.0 μg/ml作用细胞后可形成典型的凋亡形态学改变。

　　Bcl2基因是从滤泡性B淋巴细胞中分离出来的一种癌基因，正常位于18号染色体上，通过抑制细胞凋亡来延长细胞存活时间〔9〕。其中Bax基因是Bcl2家族中的一员，其生物学作用是拮抗Bcl2，与Bcl2形成二聚体，抑制或促进细胞凋亡。Li等〔10〕提出，Bcl2和Bax的比率决定了细胞凋亡的发生与否，Bax与Bcl2在调控肝细胞凋亡的过程中相互作用，共同参与调节细胞凋亡有关的现象。认为Bax与Bcl2可形成同二聚体或异二聚体来改变线粒体的通透性，从而决定细胞的生存与死亡。当Bcl2相对量高于Bax时，Bcl2同二聚体增多，促进形成Bcl2Bax异二聚体，Bcl2同二聚体和Bcl2Bax异二聚体都可抑制细胞凋亡;相反，当Bax的量相对高于Bcl2时，则Bax同二聚体增多，从而促进细胞凋亡，因而Bcl2/Bax两者之间的比例是决定细胞凋亡或存活的关键因素。本研究表明，Gen可使SMMC7721细胞Bcl2蛋白水平表达下调，并随着时间延长和剂量的增加下调更加明显，而Bax则上调其蛋白表达水平，从而使Bcl2/Bax比值下降，这可能是Gen诱导肝癌细胞凋亡的分子机制之一，即通过介导Bcl2表达下调和Bax表达上调而实现的。

　　综上，Gen可以诱导肝癌细胞凋亡，在20 μg/ml浓度时作用最为明显。Gen能降低细胞内源性Bcl2蛋白的表达并抑制其功能，提高细胞内Bax蛋白的表达，使Bax/Bcl2的比例失调，可能是其诱导肝癌细胞凋亡的机制。

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　　10 Li Y，Bhuiyan M，Momammad RM，et al.Induction of apoptpsis in breast cancer cells by TPA〔J〕.Oncogene，1998;17：291520.