转化生长因子β1和Smad4在老年结肠癌中的表达

　　作者：于金海 所 剑 作者单位：(吉林大学第一医院普外科,吉林 长春 130021)

　　【摘要】 目的 探讨转化生长因子(TGF)β1和Smad4与老年结肠癌发生发展的关系。方法 采用免疫组化和分子原位杂交的方法，对98例老年结肠癌，40例结肠炎和34例正常结肠黏膜的TGFβ1蛋白和Smad4 mRNA表达进行检测。结果 结肠癌组织中TGFβ1蛋白表达明显增强，其阳性率(79.2%)明显高于正常结肠黏膜组(35.2%)及结肠炎组(40.0%);Smad4 mRNA表达则明显降低，其阳性率(56.1%)明显低于结肠黏膜组(95.1%)及结肠炎组(85.0%)(均P<0.01),结肠癌侵及越深，TGFβ1蛋白的阳性率越高，Smad4 mRNA阳性率越低。结论 TGFβ1蛋白的高表达和Smad4 mRNA的低表达，对细胞的恶性转化及增殖有一定的生物学意义。

　　【关键词】 老年结肠癌;转化生长因子β;Smad4;免疫组化;原位杂交

　　转化生长因子(TGF)β1为多肽同源二聚体，分子量2 500，是细胞生长、分化的调节肽，研究表明TGFβ1信号转导通路的调节对肿瘤发生发展有相当重要的作用〔1，2〕;Smad4基因定位于18q21染色体上，所编码的Smad4蛋白是TGFβ信号转导通路所必需的下游中介分子。本文通过检测老年结肠癌组织中TGFβ1蛋白和Smad4 mRNA的表达，旨在探讨它们与老年结肠癌发生发展及预后的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本选取及切片 收集本院2000年10月～2004年10月结肠黏膜活检标本及手术切除共172例，其中老年结肠癌98例，结肠炎40例，正常结肠黏膜34例。98例结肠癌中，男72例，女26例，年龄67～78(平均73.2)岁;所有标本均经病理组织学确认。所用新鲜标本均经4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(含0.1%DEPC)固定2 h，石蜡包埋，载玻片经泡酸，灭菌多聚赖氨酸处理，连续切片，厚4 μm。

　　1.2 试剂来源 一抗兔抗人TGFβ1抗体为武汉博士德公司产品，二抗羊抗兔免疫球蛋白和ABC试剂盒购自福建迈新公司。Smad4原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 免疫组化染色 采用SABC法，常规脱蜡至水化，滴加3%过氧化氢20 min以抑制内源性过氧化物酶，PBS冲洗，正常羊血清封闭非特异性抗原20 min，倾去后滴加TGFβ1一抗(1∶50)，4℃湿盒内孵育过夜，PBS洗5 min 3次，滴加二抗(生物素标记)室温30 min,PBS洗5 min 3次，滴加SABC，室温20 min，自来水中止，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片观察，PBS液代替一抗作用阴性对照，乳腺癌组织标本作阳性对照。

　　1.3.2 分子原位杂交 石蜡切片常规脱蜡至水化，滴加3%过氧化氢20 min，蒸馏水洗2次，滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃10～60 min以暴露mRNA片段，滴加预杂交液，37℃4 h，吸取多余液体，滴加杂交液，恒温箱40～42℃杂交过夜;梯度SSC洗涤，滴加封闭液37℃30 min，甩去液体，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60 min，0.5 mol/L PBS洗，滴加SABC，室温20 min，PBS洗5 min 3次，DAB显色液显色3～10 min，自来水中止。苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片观察，PBS液代替杂交液作阴性对照，乳腺癌组织标本作阳性对照。

　　1.4 结果判断及统计方法 用半定量方法对结果进行分析，TGFβ1和Smad4 mRNA均以组织细胞中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，TGFβ1阳性结果判定方法：每例随机观察5个视野，每个视野100个细胞，计数500个细胞中染色阳性细胞数，<30%为-，30%～70%为+，>70%为;Smad4阳性结果判定，每例随机观察5个视野，每个视野100个细胞，计数500个细胞中染色阳性细胞数，<10%为-，≥10%为+，所有结果均经统计软件SPSS10.0 进行χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 免疫组化染色 结肠癌组织中TGFβ1阳性表达率显著高于正常黏膜组和结肠炎组(P<0.01，表1)，结肠炎组和正常结肠黏膜组间无明显差异(P>0.05)。 表1 TGFβ1蛋白和Smad4mRNA的表达结肠癌组比较：1)P<0.01

　　2.2 原位杂交染色 结肠癌组织中Smad4 mRNA表达率显著低于正常黏膜组和结肠炎组(P<0.01)，结肠炎组和正常黏膜组间无明显差异(P>0.05，表1)。

　　2.3 结肠癌组织的分化程度 Duke3、4期结肠癌组织TGFβ1阳性表达率显著高于Duke1、2;Duke1、2期癌组织Smad4 mRNA表达率显著高于Duke3、4组(P<0.05，表2)。 表2 TGFβ1蛋白和Smad4 mRNA在不同分化程度结肠癌组织的表达

　　2.4 结肠癌组织中TGFβ1表达与Smad4 mRNA阳性表达的关系 TGFβ1阳性表达结肠癌组织中Smad4 mRNA阳性率(38/78)显著低于TGFβ1阴性表达结肠癌组织的Smad4 mRNA阳性率(18/20)(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　恶性肿瘤在体内发生发展是一个错综复杂的过程，受到多种相关基因的调控，TGFβ1是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子超家族。TGFβ1是其5 种异构体之一。TGFβ1以无活性前体分子形式分泌，被激活后发挥作用。TGFβ1在胚胎生长发育、细胞分化、增殖及凋亡的调节中发挥重要作用，同时参与细胞外基质的分泌和发育分化等多种生理过程。

　　TGFβ1信号转导通路的机制是〔3〕：TGFβ1配体与膜受体(最常见的是Ⅰ、Ⅱ型)结合后，形成Ⅰ、Ⅱ型两种受体介导聚体，该异聚体可以活化(磷酸化)下游的Smad2、Smad3蛋白，而活化的Smad2、Smad3蛋白只有在与Smad4结合形成转录复合物，才能进入细胞核，调节靶基因的转录，发挥普遍的抑制生长效应。因此，TGFβ1和Smad4是TGFβ1转导通路中起瓶颈作用的关键因子。

　　TGFβ1与肿瘤的发生、肿瘤细胞的浸润及转移有密切关系。TGFβ1在肿瘤的发生、发展的不同阶段所起的作用不同，在肿瘤的早期阶段，TGFβ1抑制肿瘤的发生;在肿瘤的进展过程中，TGFβ1由肿瘤组织自分泌或旁分泌方式产生，TGFβ1的活性消失，失去抑制肿瘤的作用， Pasche〔4〕认为，在人体大部分肿瘤中，TGFβ1mRNA升高，TGFβ1蛋白表达水平增高。本研究显示，所研究的结肠癌标本中TGFβ1表达和Smad4表达呈反向相关，即结肠癌组织中TGFβ1阳性表达率显著高于正常黏膜组和结肠炎组，结肠癌组织中Smad4 mRNA表达率显著低于正常组和结肠炎组;从侵润深度方面判断，Duke3、4期结肠癌组织TGFβ1阳性表达率高于Duke1、2;Duke1、2期癌组织Smad4 mRNA表达率高于Duke3、4组，提示二者可能共同调节恶性肿瘤的发生发展和生物学行为，我们推测上述情况可能促进肿瘤细胞发生免疫逃逸。结肠癌组织中TGFβ1阳性表达率显著高于正常黏膜组和结肠炎组，并且随着结肠癌浸润深度的增加，TGFβ1蛋白表达水平增高，这与Pasche的研究结果是一致的。综合上述研究结果，我们认为，TGFβ1及Smad4 mRNA在结肠癌术后标本中的表达情况可作为结肠癌预后情况的辅助性判断指标之一，与血中CEA联合考虑，可作为预测是否复发的指标之一。

　　【参考文献】

　　1 Maehara Y, Kakeji Y, Kabashima A,et al.Role of transforming growth factor beta 1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma〔J〕. J Clin Oncol, 1999;17:60714.

　　2 Massague J.TGFβ signal transduction〔J〕. Annu Rev Biochem, 1998;67:75391.

　　3 Fan G, Ma X, Wong PY,et al.P53 dephosphorylation and p21 translocation correlate with caspade3 activation in TGFbetalinduced apoptosis of HuH7 cells〔J〕. Apoptosis, 2004; 9 (2):211.

　　4 Pasche B.Role of transforming growth factor beta in cancer〔J〕.J Cell Physiol, 2001;186(2):153.