复方参七汤对胃、结直肠癌抑制作用的实验研究

　　作者：钱晶晶，沈洪薰，陆 飞，周树军，陈玉泉 作者单位：南通大学附属医院普外科， 南通226001

　　【摘要】目的：研究复方参七汤治疗胃、结直肠癌的作用机制。方法：(1)复方参七汤对人胃癌细胞的体外抑制实验;(2)对MNNG诱发大鼠腺胃癌的体内抑制诱癌率实验;(3)对裸鼠结肠癌肝转移的体内抑制实验。结果：(1)复方参七汤对人胃癌BGC-823细胞株半数杀伤浓度(LC50)为0.048 g/ml，随药物浓度增高，杀伤作用亦增强;半数抑制浓度(IC50)为0.007 g/ml，随药物浓度增高，抑制有丝分裂指数逐渐减小，而抑制细胞集落形成亦增大;(2)复方参七汤对MNNG诱发大鼠腺胃癌发生率明显降低，实验组为6.9%(3/43)显著低于对照组58.9%(23/39)，(P<0.01);对MNNG诱发大鼠腺胃癌组织中PCNA和CyclinD1阳性表达明显降低，实验组为13.88%(5/36)和22.86%(8/35)，显著低于对照组75.76%(25/33)和62.86%(22/35)，(P<0.01);(3)复方参七汤对人结肠癌LS174t细胞株接种裸鼠肝转移的肝转移数、肝转移癌重和肝癌重/肝重明显降低，实验组为2.42±0.99，63.67±21.29和8.90±3.10，显著低于对照组4.17±1.99，94.32±37.86和13.20±5.30(P<0.05);对裸鼠肝转移血中CK20 mRNA表达的相对值减少，实验组为0.398±0.143显著低于对照组0.518±0.090，(P<0.05);对裸鼠肝转移组织中nm23H1-NDPK阳性表达呈过表达，实验组为66.67%(8/12)显著高于对照组16.6%(2/12)，(P<0.05)。结论：复方参七汤在体外实验有杀伤癌细胞作用;在体内实验抑制大鼠对MNNG诱癌率;抑制裸鼠对人结肠癌细胞肝转移的作用。

　　【关键词】 胃癌 复方参七汤 肝转移

　　Experimental study of inhibitory effect of compound Shenqitang on gastric and colorectal carcinomas

　　QIAN Jingjing, SHEN Hongxun, LU Fei, et al (Department of General Surgery, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To investigate the mechanism of therapeutic effect of compound Shenqitang on the gastric and colorectal carcinomas. Methods: Several experiments had been done, including:(1) the inhibitory effect of compound Shenqitang on human gastric adenocarcinoma cell line in vitro;(2) its inhibitory effects on Wistar rat gastric adenocarcinoma induced by MNNG; and (3) its inhibitory effect on the hepatic metastases of colorectal carcinoma in mice. Results: (1)Obvious inhibitory effects of compound Shenqitang had been found on the cell division and colony form of human gastric adenocarcinoma cell line BGC-823 in vitro. The LC50 was 0.007g crude drug/ml in colony form experiment. The drug had potent killing effect in higher concentration, with LC50 of 0.048g crude drug/ml;(2)The incidence of gastric adenocarcinoma in the experimental group(6.9%) was significantly lower than that in the control group(58.9%).The positive rates of PCNA and cyclin D1 in the experimental group were 13.88%(5/36) and 22.86%(8/35), which were significantly lower than those in the control group(P<0.01);(3)Compound Shenqitang inhibited hepatic metastases of colorectal carcinoma in mouse model. Nm23H1-NDPK positive expression rate (66.67%) was significantly higher in the experimental group than that (16.67%) in the control group(P<0.05). Conclusion: Compound Shenqitang can effectively kill the human gastric adnocarcinoma cell line BGC-823 in vitro, inhibit the incidence of the gastric adenocarcinoma induced by MNNG in Wistar rats, and inhibit hepatic metastasis of colon carcinoma in mouse model.

　　[Key words] Gastric carcinoma; Compound Shenqitang; Hepatic metastasis

　　复方参七汤在外科综合治疗胃、结直肠癌中具有重要临床意义，提高术后5年生存率分别为80%和79.17%[1~3]，为探讨其抗癌机制，本文进行了复方参七汤体内、外抑癌实验研究，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人结肠腺癌LS174t细胞株购于中科院上海细胞库，人胃癌细胞株BGC-823购于中科院上海细胞生物研究所，24只(4～6周龄)裸鼠购于中科院上海实验动物中心，100只纯系(6周龄)体重45 g左右Wistar大鼠，本院实验动物中心，复方参七汤 沈洪薰教授的经验方，由参三七、人参、黄芪、黄精、当归、陈皮、木香、伏苓、甘草、川贝、草乌、半边莲、半枝莲、谷、麦芽、佛手花等17味中药组成，化学致癌剂：N-甲基- N-硝基- N-亚硝基胍(N-methyl-N'Nitro-N-Nitrosonguanidine，MNNG)，淡黄色结晶，购自日本东京化学试剂公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 复方参七汤制备和消毒 将复方参七汤中药煎煮浓缩至每毫升药液约含1 g生药，过滤沉淀。加入2倍量95%乙醇，4 ℃过夜，滤纸过滤，并浓缩至每毫升药液含2 g生药。按上述方法重复2次，滤液加热浓缩至每毫升药液含3 g生药，G3型漏斗过滤，30分钟高压蒸汽灭菌后待用。

　　1.2.2 杀伤效应试验 按染料排斥试验法将人胃癌细胞株BGC-823细胞接种于25 ml培养瓶中，每瓶3×105个细胞，加含10%小牛血清的RPMI-1640培养基4 ml培养过夜，换以用培养基稀释的复方参七汤中药，稀释倍数分别为1∶10、20、40、80、60、320、640;对照组换以新鲜培养液。培养48 h后换新鲜培养液继续培养24 h，取细胞悬液0.4 ml，加0.4%台盼篮液染色后用血球计数板计数200个细胞，计算杀伤率。杀伤率=染色细胞数/细胞总数×100%。以浓度的对数与杀伤率作图，求出半数杀伤浓度(LC50)。

　　1.2.3 BGC-823细胞分裂 将盖玻片裁成小条放入25 ml培养瓶中。将人胃癌细胞株BGC-823细胞悬液接种在盖玻片上，培养过夜。换以用培养基稀释的复方参三七中药;对照组换新鲜培养液。24 h后，换培养液继续培养24 h，取出盖玻片，PBS漂洗，甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液中固定30 min，Giemsa液染色10 min，镜检1000个细胞计算分裂指数。分裂指数=平均各期分裂细胞数/总细胞数×100%。

　　1.2.4 BGC-823细胞株集落形成 取15 ml培养瓶，BGC-823细胞悬液2 ml，分别加入浓度为1∶80、160、240、320、400和1∶640的复方参三七中药;对照组不加药。培养24 h后换培养液，继续培养1周。甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液中固定，Giemsa 液染色，在20倍光镜下计数含50个细胞以上的集落，计算集落形成抑制率。集落形成抑制率=(种入细胞数-平均集落数)/种入细胞数×100%。以浓度的对数与集落形成抑制率作图，求出半数抑制浓度(IC50)。

　　1.2.5 实验组Wistar大鼠(50只)自由摄取MNNG 100 μg/ml溶液，连续9个月， 前6周，每周1次用1 ml饱和氯化钠溶液灌胃，自由喂给含复方参七汤(按3.6 ml/200 g大鼠体重)颗粒饲料，每日1次，连续喂养9个月;对照组(50只)不喂药，余与实验组相同。

　　1.2.6 Wistar大鼠实验诱癌期间观察 每天观察2次，每1~2月测量大鼠体重1次，实验诱癌期间自然死亡大鼠均作尸检，观察病理学改变和胃肠道癌肿发生率。

　　1.2.7 光镜观察实验组与对照组分批，取胃、十二指肠，大肠和小肠，心肝肺等脏器，胃十二指肠沿大弯侧切开，观察黏膜病变，作组织切片，HE染色，光镜观察组织形态。

　　1.2.8 免疫组化S-P法检测增殖细胞核抗原(PCNA)，细胞周期素D1(Cyclin D1)nm23H1-NDPK，鼠抗PCNA(ZYMED公司产品)，鼠抗Cyclin D1为SantaCruz公司产品，SP试剂盒购于福建迈新公司，设已知阳性切片的阳性对照及PBS代替一抗的阴性对照，细胞内出现棕黄色颗粒为阳性反应。

　　1.2.9 裸鼠结直肠癌肝转移模型 实验组和对照组BALB/C裸鼠各12只。裸鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，打开腹腔，显露脾脏。用4号针将0.1 ml细胞悬液缓慢注入脾脏下极的包膜下，拔出针头，于注射点用75%乙醇棉球压迫出血点，并杀死外渗的肿瘤细胞，5 min后将脾脏切除，腹壁全层缝合，置于SPF动物房中继续喂养。实验组每日喂以含0.6 ml/20 g体重复方参七汤颗粒饲料。对照组裸鼠喂以颗粒饲料。

　　1.2.10 大体观察 观察裸鼠的生长变化，每天记录裸鼠体重、摄食量及活动。喂养3周，处死前抽取各组裸鼠心脏血，检查肝转移癌结节数目，挖出各个癌结节并称癌重。

　　1.2.11 CK20 mRNA检测 从24只人结肠癌裸鼠肝转移的心脏采集血标本和另取10只正常裸鼠心脏血标本分别置于肝素抗凝管内，混匀，立即处理。引物合成：按文献报道基因序列合成CK20引物A，B，C，D和引物β-actin，引物1，2，由上海中科院分子生物研究所合成。

　　CK20 A: 5'-CAGACACACGGTGAACTATGG-3'，

　　B: 5'-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3'，

　　C: 5'-CGTTTGTTGGCAATGAGAAAA-TGG-3'，

　　D: 5'-GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT-3'。

　　β-actin 1: 5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，

　　2: 5'-GTTTTCTGCGCAAGGTTAGG-3'。

　　巢式PCR： 循环条件为95 ℃ 10 s，63 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s共35个循环。2次PCR扩增，除引物和模板外，其余均相同。对扩增产物进行酶切，2.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，四星图像处理系统照像。

　　1.3 统计学方法 采用Stata7.0软件，计量资料采用单因素方差分析，组间比较采用q检验，计数资料用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 复方参七汤对人胃癌细胞株BGC-823体外抑制试验结果

　　2.1.1 对BGC-823杀伤效应及对分裂指数的影响 见表1。随药物浓度的增高，杀伤作用也增强，分裂指数逐渐减少，直线回归处理，求出复方参七汤对BGC-823半数杀伤浓度为0.048 g/ml。

　　2.1.2 对BGC-823集落形成的影响 见表2。随浓度增高，集落形成抑制率而增大，经直线回归求出半数抑制浓度(IC50)为0.007 g/ml。

　　2.2 复方参七汤对Wistar大鼠实验组与对照组MNNG诱发胃癌的实验结果 见表3，图1~4。

　　2.2.1 复方参七汤对Wistar大鼠MNNG诱发胃癌影响(表3)

　　2.2.2 复方参七汤对Wistar大鼠MNNG诱发胃癌的免疫组化PCNA、CyclinD1表达影响(表4)

　　2.3 复方参七汤对BALB/C裸鼠结直肠癌肝转移实验结果

　　2.3.1 复方参七汤对裸鼠肝转移灶的影响(见表5)。

　　2.3.2 复方参七汤对裸鼠肝转移血中CK20 mRNA表达影响 实验组和对照组裸鼠肝转移血中CK20 mRNA阳性表达率分别为91.6%(11/12)和100.0%(12/12)，P>0.05，另外10只裸鼠血中CK20 mRNA均呈阴性表达，随后对实验组和对照组裸鼠血中CK20 mRNA采用半定量法，计算出CK20 mRNA表达的相对值，实验组0.398±0.143，对照组0.518±0.090，两组差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3.3 复方参七汤对裸鼠肝转移组织中nm23H1-NDPK表达影响 实验组裸鼠肝转移组织中nm23H1-NDPK表达为66.67%(8/12)，对照组裸鼠肝转移组织中nm23H1-NDPK表达为16.67%(2/12)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　3.1 复方参七汤可提高胃结直肠癌的手术疗效 已有文献报道胃癌术后患者长期服用复方参七汤组5年、8年和10年生存率分别为80%、60%、57.1%，优于对照组的58.6%、40%和14.3%(P<0.05)[2]。有报道结直肠癌术后患者长期服用复方参七汤，长期服用中药3年、5年生存率分别为80.95%和66.67%，优于对照组，分别为47.62%和33.33%[1](P<0.05)。

　　3.2 体外实验抑制人胃癌细胞 本研究显示复方参七汤对人胃癌细胞株BGC-823细胞具有直接杀伤效应， LC50为0.048 g/ml;对BGC-823细胞的有丝分裂有抑制作用;对BGC-823细胞集落形成有抑制作用，IC50为0.007 g/ml。这些结果表明中药复方参七汤可直接杀伤癌细胞，与张氏报道复方中药注射液对人胃癌细胞有杀伤效应相同[4]。

　　3.3 体内实验抑制大鼠诱发胃癌 MNNG胃腺癌诱发率为63%~90%[5]，朱氏报道为80.7%[6]。本组为58.9%，可能与大鼠对MNNG的敏感性、含量、浓度和服用时间有关。本组这一表现提示复方参七汤对MNNG致胃黏膜直接损害有保护作用。

　　本实验应用PCNA和Cyclin D1表达程度来反映大鼠腺胃细胞增殖程度和增殖性细胞周期G1的变化，由表3可发现，对照组PCNA和Cyclin D1表达分别为75.76%和62.86%，与我们研究的PCNA标记指数(PCNA Li)，Cyclin D1表达61.88%和80.88%相近[7]。但实验组PCNA和Cyclin D1表达明显下降，分别为13.88%和22.86%。这一表现提示复方参七汤具有降低大鼠MNNG诱发腺胃癌中的PCNA和Cyclin D1表达，抑制诱发胃癌的发生与发展，这与徐莉报道的参麦可减少肿瘤中PCNA表达的结果相似[8]。

　　3.4 体内实验抑制裸鼠结直肠癌肝转移 实验组裸鼠实验前后体重增长明显高于对照组;实验组裸鼠肝转移癌结节的数目明显少于对照组;实验组裸鼠肝转移癌重明显低于对照组;实验组裸鼠肝转移癌重/肝重比例明显低于对照组。这些表现阐明复方参七汤具有抑制人结肠癌细胞肝转移的作用。血中CK20 mRNA表达可作为人结肠癌细胞存在于循环的指标：谬氏报道[9]大肠癌患者外周血中CK20和CEA阳性表达是大肠癌患者外周血存在癌细胞的重要证据。本组研究发现正常裸鼠血中CK20 mRNA为阴性，而实验组血中CK20 mRNA表达的相对值明显低于对照组，提示复方参七汤可抑制裸鼠结肠癌肝转移血中CK20 mRNA表达。nm23H1可作为复方参七汤抑制裸鼠结肠癌肝转移指标。本实验成功建立了人结肠癌细胞株接种裸鼠肝转移模型，肝转移组织中nm23阳性表达率66.67%(8/12)明显高于对照组16.6%(2/12)，与何萍[10]报道nm23H1蛋白表达与肿瘤远处转移之间呈负相关结论相似，提示复方参七汤具有抑制结直肠癌肝转移作用。

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