重症急性胰腺炎模型大鼠促炎性因子和COX2动态变化及塞来昔布干预效应的研究

　　作者：杨闯 王广义 作者单位：吉林大学第一医院普通外科，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 探讨重症急性胰腺炎(SAP)模型鼠血清促炎性细胞因子IL1β、IL6和TNFα以及胰腺组织中环氧化酶2(COX2)的变化及选择性COX2抑制剂塞来昔布的干预效应。方法 雄性SD大鼠120只，随机分为假手术组、SAP模型组、塞来昔布组和地塞米松组，每组各30只。各组于术后6、12和24 h 3个时相处死大鼠测血清IL1β、IL6和TNFα水平，每次10只;取各组术后24 h处死大鼠的胰头组织，行HE染色及免疫组化染色，分别观察大鼠胰腺组织病理学变化及COX2的表达情况。结果 假手术组胰腺组织基本正常，SAP模型组胰腺腺泡结构严重破坏消失，血管消化，大片坏死灶周围大量炎性细胞浸润。塞来昔布组和地塞米松组各时相病理改变明显减轻，仅见腺泡和间质水肿，炎性细胞浸润或伴轻度出血和局灶性坏死;SAP模型组、塞来昔布组和地塞米松组大鼠血清中IL1β、IL6、TNFα水平随病程进展而升高(P<0.05)，各时相SAP组、塞来昔布组和地塞米松组水平明显高于假手术组(P<0.01，P<0.05)，SAP模型组水平明显高于塞来昔布组和地塞米松组(P<0.01)，而塞来昔布组和地塞米松组之间无显著差异(P>0.05);SAP模型组、塞来昔布组和地塞米松组的COX2阳性率分别为90%，60%和50%，假手术组中阳性率为0，SAP模型组COX2阳性率高于两个组(P<0.05)。结论 IL1β、IL6和TNFα介导了SAP的发生和发展，并且增加了COX2在SAP中的表达活性;选择性COX2抑制剂塞来昔布可以减轻SAP的炎症反应，间接抑制促炎症性细胞因子的产生。

　　【关键词】 SAP 促炎症性细胞因子 COX 2 塞来昔布

　　重症急性胰腺炎(SAP)的发病机制至今仍不清楚，但细胞因子和炎症反应失衡理论在其发病机制中的重要地位现已得到公认〔1〕。最近的研究表明，SAP伴发的炎性细胞因子瀑布样级联反应，在导致全身炎症反应综合征(SIRS)甚至多器官功能障碍综合征(MODS)中起重要作用，其中TNFα、IL1β和IL6是重要的促炎症性细胞因子〔2～4〕。环氧合酶2(COX2)COX2自身受某些炎症因子的调节，其在SAP发生发展中的作用不可忽视〔5〕。塞来昔布(Celecoxib)是新一代的非甾体类化合物，可选择性抑制COX2而阻止炎性PGs类物质的产生，达到抗炎、镇痛及退热的作用。本研究旨在探讨炎性因子和COX2在大鼠SAP发病机制中的作用，并观察塞来昔布对SAP大鼠的干预效应。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　健康清洁级雄性SD大鼠120只，体重250～300 g，随机分为假手术组、SAP模型组、塞来昔布组和地塞米松组(n=30)。

　　1.2 造模及给药

　　采用改良Aho′s逆行胰胆管穿刺注射法制备SAP模型，大鼠术前禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠进行麻醉(0.25 ml/100 g)，经上腹部正中切口进腹，充分暴露胰腺，顺胰胆管走行辨认十二指肠管壁内侧潜行的十二指肠乳头开口，用针头于对系膜缘肠壁无血管区戳一小孔，将细导管经小孔插入十二指肠肠腔，导管前端贴系膜缘肠壁向乳头开口方向滑行，沿乳头方向插入胰胆管约4～5 mm，用血管夹夹住导管头部，同时于肝管汇合处夹闭肝总管。用微量注射泵逆行注入5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g)，0.2 ml/min，注射完毕后停留4～5 min，观察到大鼠胰腺组织出现肉眼可见的水肿、出血，说明制作SAP模型成功。假手术组仅翻动胰腺和十二指肠，并以钝器轻划胰腺3次。塞来昔布组及地塞米松组分别在造模同时，经腹腔注入塞来昔布(30 mg/kg)和地塞米松(2 mg/kg)。于造模后6、12和24 h处死大鼠，每组10只，采集血清和胰腺组织标本。

　　1.3 血清IL1β、IL6和TNFα水平测定

　　均按ELISA检测试剂盒(Sigma公司)操作说明书进行。

　　1.4 病理学检查

　　取造模后24 h处死大鼠的胰头组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色观察病理学改变。免疫组化染色(SABC法，Sigma公司)，进行半定量评分，计算COX2阳性率，细胞浆内呈棕黄色者为阳性，阴性者为0分，弱阳性者1分，阳性者2分，强阳性者3分;阳性细胞率即阳性细胞的比例，以计数10个高倍镜视野为准，≤5%为0分，6%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分，两项之和0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为阳性，9～12分为强阳性，以已知阳性切片作为阳性对照。

　　1.5 统计学分析

　　计量资料以x±s表示，计数资料以百分比表示，利用SPSS11.0软件进行组间t检验和χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 胰腺病理学改变

　　显微镜下观察结果显示，假手术组胰腺组织基本正常，SAP模型组胰腺腺泡结构严重破坏消失，血管消化，腺管扩张，动脉血栓形成，大片坏死灶周围大量炎性细胞浸润。塞来昔布组和地塞米松组无明显差异，各时相病理改变明显减轻，仅见腺泡和间质水肿，炎性细胞浸润或伴轻度出血和局灶性坏死。

　　2.2 不同时相各组IL1β、IL6和TNFα水平

　　各时相SAP模型组、塞来昔布组和地塞米松组明显高于假手术组(P<0.01，P<0.05)，SAP模型组水平明显高于塞来昔布组和地塞米松组(P<0.05)，而两组之间无显著差异(P>0.05)(表1～表3)。表1 不同时相各组IL1β水平(略)表2 不同时相各组IL6水平(略)表3 不同时相各组TNFα水平(略)

　　2.3 各组COX2阳性表达

　　假手术组胰腺组织中未见COX2表达，SAP模型组、塞来昔布组和地塞米松组COX2阳性细胞率分别为90%、60%和50%，SAP模型组高于其他各组(P<0.01)，两组间无明显差异(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　IL1β是典型的促炎症性细胞因子，在急性胰腺炎(AP)的炎症反应过程中有重要的作用。它能启动炎症级联反应，活化内皮细胞，促进中性粒细胞迁移和黏附分子的表达。IL1β与TNFα具有协同效应，是导致胰腺持续坏死和全身病情加重的重要因素。IL6受内毒素、IL1等刺激后由单核巨噬细胞等多种细胞分泌，其主要功能是活化淋巴细胞，引起机体发热反应，是促炎症因子中最有价值预测SAP预后的指标，其水平与SAP严重程度及并发症的发生率呈正相关。TNFα是由单核巨噬细胞和T淋巴细胞等多种细胞分泌的，能够活化血管内皮细胞，引起发热反应和休克，增加血管通透性等。TNFα还能与其他多种细胞因子发生相互作用，如IL1、IL6和血小板活化因子(PAF)等，在炎症反应中具有非常重要的作用，是SAP发生时体内重要的细胞因子之一，是导致胰腺及胰外器官组织释放其他炎症介质、细胞因子的重要启动因子，与SAP的严重程度密切相关。本研究结果显示，SAP模型组中IL1β、IL6、TNFα水平各时相均明显高于其他各组，而且随病程的进展而进一步升高，从而提示这些激活的炎症因子IL1β、IL6、TNFα介导并加重了SAP的炎症反应。COX2在正常组织中极少表达，当受到炎症因子如TNFα、IL1β、IL6 、IL8等刺激后即可表达增加，参与炎症反应〔6,7〕。本研究结果发现，IL1β、IL6和TNFα水平升高的同时，COX2表达阳性率也随之升高，说明COX2表达与IL1β、IL6、TNFα的表达水平具有相关性。进一步证实了COX2与SAP的发生发展有着密切的关系。塞来昔布属非甾体类抗炎药，能选择性抑制COX2，减少前列腺素的产生，进而抑制炎症反应的发生。本研究中塞来昔布和地塞米松组中IL1β、IL6、TNFα水平及COX2表达阳性率显著低于SAP组，说明在SAP模型大鼠中，塞来昔布具有和地塞米松相似的抗炎作用。塞来昔布对COX2的选择性抑制，可能间接抑制了IL1β、IL6和TNFα等促炎症性细胞因子的产生，并进一步拮抗炎症反应的发生，该研究结果提示塞来昔布可能在SAP的治疗中具有良好的应用前景，其具体作用机制仍需进一步探究。

　　【参考文献】

　　1 Gloor B, Schmidtmann AB, Worni M,et al. Pancreatic sepsis: prevention and therapy〔J〕. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2002;16(3):37990.

　　2 Mayer J, Rau B, Gansauge F,et al. Inflammatory mediators in human acute pancreatitis: clinical and pathophysiological implications〔J〕. Gut, 2000;47(4):54652.

　　3 Hirota M, Nozawa F, Okabe A, et al. Relationship between plasma cytokine concentration and multiple organ failure in patients with acute pancreatitis〔J〕. Pancreas,2000;21(2):1416.

　　4 Galloway SW, Kingsnorth AN. Reduction in circulating levels of CD4+ lymphocytes in acute pancreatitis: relationship to endotoxin, interleukin 6 and disease severity〔J〕. Br J Surg, 1994;81(2):312.

　　5 Song AM, Bhagat L, Singh VP, et al. Inhibition of cyclooxygenase2 ameliorates the severity of pancreatitis and associated lung injury〔J〕. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2002;283(5):G116674.

　　6 Willoughby DA, Moore AR, ColvilleNash PR. COX1, COX2, and COX3 and the future treatment of chronic inflammatory disease〔J〕. Lancet, 2000;355(9204):6468.

　　7 Turini ME, DuBois RN. Cyclooxygenase2: a therapeutic target〔J〕. Annu Rev Med, 2002;53:3557.