Spantide对急性坏死性胰腺炎胰腺肠源性感染治疗作用的研究

　　作者：宿士智 作者单位：首都医科大学大兴医院 普外科一区，北京 102600

　　【摘要】 研究P物质受体拮抗剂Spantide能否减少肠道细菌移位的发生﹑减轻胰腺肠源性感染并提高实验动物的生存率。方法:将健康成年SD大鼠随机分为对照组(24只)和实验组(再分为NS、P物质和Spantide 3组，每组34只)。除实验组分别各取10只作48h死亡率观察外，余均于制模成功后8h和16h处死。取末端回肠行病理组织学评分;用放免γ计数器测定尿液中99m锝亚锡喷替酸(99mTcDTPA)的脉冲数，计算肠黏膜通透性;取胰腺和末端回肠内容物作细菌培养。结果:Spantide组与NS组及P物质组比较，肠黏膜病理学改变明显减轻，胰腺细菌培养阳性率也明显降低(P<0.05)。Spantide组48h死亡率明显低于其它两组(P<0.05)。结论:使用P物质受体拮抗剂Spantide可明显减轻急性坏死性胰腺炎时胰腺肠源性感染的程度，提高实验大鼠的生存率。

　　【关键词】 急性坏死性胰腺炎 神经激肽1受体 P物质 肠系膜淋巴结 大鼠 SpragueDawley

　　急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)病情凶险，死亡率高。胰腺及胰周感染是急性胰腺炎的严重并发症，临床上急性胰腺炎死亡的病人中80%是由于胰腺坏死组织继发感染所致。胰腺感染主要是指由移位的肠道细菌或毒素所致的肠源性感染。

　　近年来研究发现，P物质及其受体在急性胰腺炎的发生发展中起到了重要作用[14]。我们以往的研究[35]证实：ANP大鼠肠壁上P物质及其受体表达升高，P物质通过与表达增加的神经激肽1受体(NK1R)结合介导炎症反应，加重肠壁病理损伤，引起肠黏膜通透性增加，加重胰腺肠源性感染。应用NK1R拮抗剂可阻断P物质的作用路径，对ANP急性肺损伤有一定的治疗作用。然而，应用P物质受体拮抗剂能否减轻肠黏膜屏障的损害以及能否减少细菌移位的发生仍不清楚。

　　本实验通过制作ANP大鼠模型，研究P物质受体拮抗剂Spantide对ANP时肠黏膜屏障是否具有保护作用，以及Spantide能否减轻ANP胰腺肠源性感染﹑降低实验动物死亡率等。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　健康成年SD大鼠126只，体质量250 280g，雌雄各半，由东南大学医学院实验动物中心提供;P物质、Spantide(NK1R拮抗剂)以及牛磺胆酸钠购自Sigma公司;浓缩型兔抗大鼠P物质抗血清、即用型SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;亚锡喷替酸(DTPA)购自中国原子能科学研究院同位素所;锝(99mTC)购自中国核动力研究设计院第一研究所。

　　1.2 实验方法及步骤

　　1.2.1 实验分组 将126只大鼠随机分为对照组24只、ANP实验组102只。ANP实验组又分为生理盐水(NS)组、P物质组、Spantide组，每组34只。

　　1.2.2 模型制作 大鼠用3%戊巴比妥钠(按体质量每100g 0.1ml)腹腔注射麻醉后妥善固定，取上腹正中切口，切开腹壁进入腹腔。将十二指肠提出切口，向胰管以恒定速度(0.1ml·min-1)注入5%牛磺胆酸钠(按体质量每100g 0.1ml)，并于近端空肠内缓慢注入100μCi 99mTcDTPA(同位素99mTc 标记的大分子物质亚锡喷替酸)。ANP制模后10min，各组大鼠尾静脉相应地缓慢注射NS、0.0025% P物质及Spantide 0.5ml。关腹后向大鼠背部皮下注入NS 4 6 ml。将其放入代谢笼，留取8h和16h尿液。ANP各组分别取10只大鼠用于48h死亡率和生存时间观察，其余ANP各组大鼠分别于8h和16h处死采取标本。

　　对照组仅将十二指肠提出切口，轻轻翻动胰腺3次，然后回纳腹腔，关腹，而不注射牛磺胆酸钠。

　　1.2.3 肠黏膜通透性的检测 99mTcDTPA在体内不代谢，可通过尿液测定其含量。尿液中同位素脉冲数可以间接反映肠黏膜通透性[67],即：

　　肠黏膜通透性(%)=99mTcDTPA排泄率(%)=[(尿液测定值-本底测定值)×总尿量/(药物测定值-本底测定值)]×100。

　　1.2.4 标本采取 称取8h和16h大鼠尿液，用放射免疫γ计数器测定尿中99mTcDTPA脉冲数。取部分胰腺和回肠内容物分别做需氧菌和厌氧菌培养。切取部分末段回肠组织，留作光镜和电镜检查。

　　1.2.5 肠壁的病理学检查 取末端回肠组织于10%福尔马林溶液及4%戊二醛中固定，分别进行光镜和电镜观察。用单盲法对胰腺和肠黏膜组织进行病理学评分[89]。

　　1.2.6 各ANP组动物48h死亡率和平均生存时间观察 各ANP组分别取10只大鼠，自模型制作成功至动物死亡为止，计算各ANP组大鼠的死亡率和平均生存时间。

　　1.3 统计学处理

　　用SPSS软件对数据进行统计学分析，计量资料采用t检验，各组数据以x-±s表示;计数资料采用四格表确切概率计算法。P<0.05被认为两组间有显著差异。

　　2 结 果

　　2.1 末端回肠的病理学检查

　　肉眼观察：NS组和P物质组大鼠腹腔内可见较多血性腹水，肠系膜、大网膜出现皂化斑，胰腺可见充血水肿、出血坏死灶及皂化斑，病变以胰头、体部为重，结肠及小肠管壁充血水肿，小肠色泽暗红，肠蠕动明显减少，弹力减弱，部分大鼠肠管内可见血性内容物;Spantide组大鼠腹腔内可见少量淡黄色腹水，肠系膜、大网膜可见少量皂化斑，胰腺可见轻度充血水肿及皂化斑，肠管壁轻度水肿，形态学改变较前减轻;对照组大鼠腹腔内无腹水，胰腺和肠管未见明显异常改变。

　　光镜观察：对照组肠黏膜无异常，NS组和P物质组大鼠在制模后8h肠黏膜即出现水肿，黏膜上皮变性、坏死、脱落，局部肠黏膜表面被覆假膜，黏膜及黏膜下层可见血管扩张、出血及炎症细胞浸润，16h后以上病理变化加重;Spantide组大鼠肠黏膜轻度水肿，黏膜及黏膜下层血管扩张充血及炎症细胞浸润减轻。

　　电镜下观察：NS组和P物质组大鼠在制模后16h肠微绒毛坏死、脱落，线粒体肿胀，细胞紧密连接破坏，Spantide组以上病理变化减轻。单盲法病理学评分结果见表1。表1 各组肠黏膜组织病理学评分1)与对照组比较，P<0.01;2)与Spantide组比较，P<0.05

　　2.2 肠黏膜通透性的改变见表2。表2 各组大鼠肠黏膜通透性的测定值(1)与对照组比较，P<0.01;2)与Spantide组比较，P<0.05;NS组与P物质组比较P>0.05

　　2.3 细菌培养结果 见表3。表3 8、16 h胰腺组织细菌培养阳性结果株 NS组、P物质组在成模后8、16 h细菌培养阳性率明显增加(P<0.05)，而Spantide组细菌培养阳性率在相应时间点较NS组和P物质组显著降低(P<0.05)。

　　需氧菌培养阳性的细菌经形态学检查鉴定，胰腺中大肠杆菌占78.95%(30/38)，余为G+杆菌、G-球菌及G+球菌。厌氧菌培养阳性的细菌经过形态学鉴定均为脆弱类杆菌。

　　末端回肠内容物需氧菌培养以大肠杆菌占多数，另可见G+杆菌、G-球菌及G+球菌。厌氧菌培养以脆弱类杆菌为主。

　　2.4 各ANP实验组大鼠48h死亡率和生存时间 见表4。表4 各实验组大鼠48h死亡率和生存时间

　　3 讨 论

　　基于P物质及其受体在ANP发病机制中的重要作用，许多学者尝试应用P物质受体拮抗剂来阻断P物质与其受体的结合，进而观察此拮抗剂能否减轻ANP的病情，能否缓解ANP伴发的器官功能障碍。Figini等[10]研究发现,P物质可与小鼠小肠和胰腺上P物质受体作用，刺激毛细血管后微静脉血浆外渗，这种渗出可被其相应拮抗剂阻滞。Womack等[11]认为，NK1R拮抗剂CP96345可以阻断P物质与位于胰腺腺泡和内皮细胞上的NK1R结合，减少血浆渗出。Sonea等[12]指出，在大鼠炎性肠病模型中，肠壁上NK1R表达升高，通过应用P物质受体拮抗剂特异性地阻滞P物质与其受体的结合，阻断引起肠损害的炎性介质的瀑布样释放，从而减轻肠损害。

　　NK1R拮抗剂能否减轻ANP时的肠黏膜损害,能否减少细菌移位的发生以及延长动物的存活时间，尚未见文献报道。我们以往的研究已证实[35]，ANP时回肠黏膜P物质表达升高，肠黏膜通透性增加，应用P物质受体拮抗剂Spantide可减轻ANP时的急性肺损伤，缓解ANP病情，延长实验动物生存率。本次实验分别应用P物质和Spantide干预，观察ANP时肠道屏障功能的损伤情况。结果发现，Spantide组大鼠术后8h和16h肠黏膜病理学评分较NS组明显低，表现为肠壁充血水肿减轻，黏膜下血管扩张充血减轻以及炎症细胞浸润减少，同时行肠黏膜通透性检查发现，Spantide组大鼠在成模后8h和16h较NS组肠黏膜通透性明显下降，细菌移位发生率降低。应用P物质受体拮抗剂Spantide可通过阻断P物质与其肠壁上相应受体的结合，从而抑制P物质前炎症递质作用的发挥，从一定程度上减少了炎症介质的连锁样释放，进而减轻肠道病理损害，减少细菌移位的发生。本实验还通过测定大鼠48h死亡率以及存活时间来了解Spantide的治疗效果，实验显示，Spantide组大鼠48h死亡率较NS组显著降低，存活时间明显延长。这表明，NK1R拮抗剂Spantide可改善ANP病情，通过阻断P物质与NK1R的结合，能够有效减轻ANP肠道屏障的损害，减少胰腺肠源性感染的发生，从而提高实验动物的生存率。

　　【参考文献】

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