结肠癌组织中MIF、VEGFC 和MMP9的表达及其临床意义

　　作者：余启文，包仕廷 作者单位：1. 广东省江门市新会区人民医院外科，广东江门 529100;2. 广东医学院附属医院外科，广东湛江 524001

　　【摘要】目的 探讨结肠癌组织中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、血管内皮生长因子C(VEGFC)和基质金属蛋白酶9 (MMP9)的表达以及与肿瘤分期、分化程度和转移等之间的关系。方法 应用免疫组织化学法检测122例结肠癌组织中MIF、VEGFC和MMP9蛋白表达情况，并结合临床病理进行分析。结果 结肠癌组织中MIF、VEGFC和MMP9的阳性表达率显著高于远癌肠黏膜的表达(P<0.01);结肠癌MIF、VEGFC和MMP9的表达与Dukes分期、组织分化程度及有无淋巴结转移有关(P<0.05);MMP9、VEGFC共同表达与其他组相比淋巴结转移率明显增高(P<0.05)。结论 MIF、VEGFC和MMP9蛋白在结肠癌肿瘤形成、恶性进展和浸润、转移等方面起着重要作用，检测这些指标对进一步了解结肠癌细胞的生物学行为、判断预后具有重要意义。

　　【关键词】 巨噬细胞移动抑制因子 血管内皮生长因子C 基质金属蛋白酶 9 结肠癌 免疫组织化学

　　结肠癌是常见的肿瘤恶性，其发病率高，具有易种植、高转移、高复发等特点，严重影响人们的身心健康。免疫功能异常、血管与淋巴系统生成功能增强、组织基底膜被破坏等是造成它发病特点的重要环节。本研究运用免疫组化方法检测结肠癌组织与远癌组织的巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)、血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGFC)和基质金属蛋白酶9 ((matrix metallo proteinase，MMP9)蛋白的表达差异，分析它们与肿瘤分期、分化程度和转移等之间的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料

　　结肠癌组织122例，均为我院病理科2004年1月至2008年10月间手术切除的大肠癌石蜡包埋组织，其中男70例，女52例，年龄27.5～87.3岁，平均(57.4±17.6)岁。病理分期：以国际抗癌联盟制定的分期为标准，I期32例，Ⅱ期37例，Ⅲ期53例;高分化49例，中分化40例，低分化33例;淋巴结转移阳性58例，阴性64例。远癌大肠黏膜 30例，均取自大肠癌行肠切除的远侧断端肠黏膜，所有断端均距癌组织5 cm以上，组织学检查为基本正常肠黏膜。

　　1.2 方法

　　标本10%甲醛固定，常规石蜡包埋后行4μm连续切片，行HE染色和免疫组织化学染色(SP法)。免疫组织化学染色时用3%H2O2阻断20 min，置于0.01 mmol/L枸橼酸(pH=6.0)修复液修复2次，正常山羊血清置37℃ 恒温孵育箱中封闭30　min，滴加特异性抗体(MIF的工作浓度为1∶50，VEGFC和MMP9的工作浓度为1∶100)，置37 ℃恒温孵育箱中孵育30 min，冰箱中过夜。次日加生物素标记二抗37 ℃恒温孵育30 min，链酶素抗生物素过氧化物酶溶液37 ℃恒温孵育30 min后PBS溶液和蒸馏水洗，再用DAB液显色，苏木素复染。各项阳性对照用已知阳性结肠癌切片;阴性对照用0.01 M PBS液(pH=7.4)代替一抗进行操作。所用抗体均为兔抗人多克隆抗体。

　　1.3 结果判断

　　MIF、VEGFC和MMP9蛋白染色阳性均为在胞质内出现棕黄色颗粒，且其着色强度高于背景非特异性染色者。每例切片随机选取5个高倍视野进行结果判定。按染色强度及阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分比综合计分。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞数：小于总数的5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。染色强度得分与阳性细胞数得分相乘，0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性()，≥ 6分为强阳性()。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS11.0统计软件进行分析，采用χ2检验及等级资料的秩和检验。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 MIF、VEGFC和MMP9在结肠癌组织中的表达

　　结肠癌组织中MIF、VEGFC和MMP9的阳性表达率显著高于远癌肠黏膜的表达(P<0.01)，见表l。表1 MIF、VEGFC和MMP9在结肠癌组织和远癌组织中表达的比较(略)

　　2.2 MIF、VEGFC和MMP9在结肠癌中的表达及与临床病理的关系

　　大肠癌组织中MIF、VEGFC和MMP9蛋白的表达与Dukes分期、组织分化程度及有无淋巴结转移有关(P<0.05)，见表2。表2 MIF、VEGFC和MMP9蛋白与大肠癌临床病理参数的关系(略)

　　病理分期：I vs Ⅱ、I vs Ⅲ、Ⅱvs Ⅲ，均P<0.05 ;肿瘤分化程度：高分化vs低分化、高分化vs中分化、低分化vs中分化，均P<0.05;淋巴结转移：阳性vs阴性P<0.05。

　　2.3 VEGFC和MMP9的共同表达与淋巴结转移的关系

　　MMP9、VEGFC共同表达与其他组相比淋巴结转移率明显增高(P<0.05)，且VEGFC和MMP9共同表达阳性的患者数量明显高于其它的组合，见表3。表3 VEGFC和MMP9的共同表达与淋巴结转移的关系(略)

　　3 讨论

　　MIF是体内一种重要的多功能细胞因子，长期以来，人们认识到MIF在机体炎症反应中起作用，其主要来源于垂体前叶细胞、活化的T淋巴细胞、单核/巨噬细胞等细胞[1]。除了免疫系统之外，MIF广泛表达于其他系统、组织的细胞中，近年逐渐发现MIF在肿瘤发展和演进过程中的作用。它参与肿瘤的发病机制：(1) MIF促进肿瘤细胞的分裂增殖：MIF通过持续、快速磷酸化激活ERKl、ERK2、MAPK信号转导，使处于生长静止期的细胞活化增殖; (2) MIF促进肿瘤血管生成：关于MIF与肿瘤微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)以及IL8等报道证实MIFmRNA的表达程度与MVD、VEGF成正相关。对诱导肿瘤血管形成起主要作用的MIF可能更多的来源于肿瘤细胞本身的自分泌，而缺氧和低血糖是诱导血管形成的最根本的因素，而且MIF与VEGF的表达程度呈现为强烈的正相关[2];(3) MIF对其他抑癌基因的转化：MIF可以通过对ERK、PLA2、Cox2等系列细胞因子的激活来拮抗P53基因引起的细胞凋亡，参与调节细胞的生长周期[3]。

　　肿瘤的复发和转移是多步骤、多基因参与的复杂过程，其中肿瘤周围淋巴管分布，淋巴管内皮细胞增生、迁移，基底膜的完整与否等因素是肿瘤细胞向邻近组织浸润进而向远处转移过程中最重要的环节。VEGFC可通过MEK/ERK和PI3K/Akt途径引起发育中的淋巴管内皮细胞增生、迁移及抑制内皮细胞的凋亡，从而发挥促淋巴管新生的作用。有研究表明，VEGFC在很多肿瘤中均有阳性表达，其在肿瘤中的高表达与肿瘤淋巴管新生及淋巴结转移密切相关。同时有报道指肿瘤细胞能分泌大量金属基质蛋白酶(MMPs)，能降解细胞外基质，MMP9是MMPs中相对分子质量最大的酶，被激活后形成Ⅳ型胶原酶，能降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质中的Ⅳ型、V型胶原和明胶[4]，促进肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织浸润，最终导致肿瘤的侵袭和转移[5]。

　　本研究结果显示，大肠癌中MIF 、VEGFC和MMP9的表达明显高于正常组织，说明它们在肿瘤的发生、发展过程中可能起到重要的作用;同时研究表明，MIF、VEGFC和MMP9表达与肿瘤分期、分化程度和转移有密切关系;证实了MIF 、VEGFC和MMP9与肿瘤的恶性程度与进展情况有关，VEGFC和MMP9尤其与大肠癌的侵袭性、转移性有关。我们的研究还发现，在结肠癌淋巴结转移组VEGFC和MMP9共同表达阳性的表达率均高于淋巴结无转移组(P<0.05)，而且VEGFC和MMP9共同表达阳性的患者数量明显高于其它的组合，说明两者可能在结肠癌淋巴结转移中起协同作用，我们推测结肠癌细胞分泌VEGFC，促进新生淋巴管形成，增加肿瘤细胞向淋巴淋巴系统转移的几率;同时MMP9提高肿瘤细胞突破基底膜的能力，使肿瘤细胞更容易进入淋巴管，从而促进肿瘤扩散与转移。所以在诊断与治疗结肠癌患者时，应密切关注MIF、VEGFC和MMP9表达的情况，这对判断预后，指导制定手术后的治疗方案有十分重要的作用。

　　【参考文献】

　　[1]Bozza M,Satoskar A R,Lin G,et a1.Targeted disruption of migration inhibitory factor gene reveals its critical role in sepsis[J].J Exp Med,1999,189(2):341346.

　　[2]蔡施霞,余细勇,林秋雄. MIF促进新生微血管生成及其相关基因表达的研究[J].中国心血管杂志,2007,12(3):169.

　　[3]Mitchell R A,Liao H,Chesney J,et a1.Macrophage migration inhibitory factor(MIF) sustains macrophage proinflammatory function by inhibiting p53：regulatory role in the innate immune response[J].Proc Nail Acad Sci USA,2002,99(2):345350.

　　[4]2 Yu Q, Stamen kovic L. Localization of matrix matalloproteinase 9 to the ceil surface provides a mechanism for CD44mediated tumor invasion[J].Genes Dev, 1999, 13(1):3548.

　　[5]徐峰,刘华,许春进. CD44V6和MMP9及P53的表达与胃癌患者淋巴结转移的关系[J]. 新医学, 2004, 35(3):l53155.