TRAIL联合5氟脲嘧啶体外杀伤胆管癌细胞作用的研究

　　作者：丁永年， 段永亮, 杨旭， 邹声泉 作者单位：新疆医科大学第二附属医院消化科，普外科, 新疆乌鲁木齐830028;华中科技大学同济医学院附属同济医院普外科， 湖北武汉430030

　　【摘要】目的：探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( TRAIL)对人胆管癌的作用及联合化疗药物5氟脲嘧啶(5FU)共同作用胆管癌细胞对TRAIL抗瘤活性的影响。方法：应用四氮唑蓝快速比色(MTT)检测单独应用不同浓度TRAIL(1、10、100、1 000 ng/ml)及不同浓度(1、10、100、1 000 ng/ml)TRAIL +10 mmol/ml 5FU对胆管癌细胞QBC939活性的抑制作用。结果：单独应用(1、10、100、1 000 ng/ml)TRAIL作用于QBC939细胞后抑制率分别为15.6%、31.2%、37.5%、40.6%(1、10、100、1 000 ng/ml)TRAIL +10 mmol/ml 5FU作用于QBC939细胞后抑制率分别为46.9%、62.4%、68.7%、78.1%，5FU与TRAIL联合应用对QBC939细胞抑制率明显高于单独应用TRAIL(P<0.05)。结论：TRAIL通过诱导胆管癌细胞凋亡而起到抑癌作用，化疗药物5FU能加强TRAIL的抗癌活性。

　　【关键词】 胆管癌细胞; 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体; 5氟脲嘧啶

　　Effects of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand alone and in combination with 5fluorouracil on cholangiocarcinoma cells

　　DING Yongnian, DUAN Yongliang， YANG Xu， et al

　　(Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University,Urumqi 830028, China)

　　Abstract: Objective: To investigate the antitumor effects of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) alone and in combination with 5fluorouracil (5FU) on cholangiocarcinoma cells. Methods: Cell viability was assessed by the MTT dye reduction assay, we tested the activity of TRAIL and 5FU against QBC939 cholangiocarcinoma cells, in addition, measured the combined effect of these 2 agents. Results: MTT assay showed that TRAIL significantly inhibited the growth of human cholangiocarcinoma cell line (QBC939) dosedependently. 5FU could enhance the antitumor effects of TRAIL. Conclusion: TRAIL could inhibit QBC 939 cell proliferation . TRAIL and 5FU cooperate effectively at preventing tumor growth.

　　Key words: cholangiocarcinoma cells; tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand (TRAIL); 5fluorouracil

　　肝门部胆管癌是一种侵袭性恶性肿瘤，占肝外胆管癌的2/3，其部位高，早期诊断困难，手术切除率低，对放疗和化疗均不敏感[1]，因此，探索一条新的治疗途径非常必要。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是近几年新发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族新成员，由于其能够诱导多种肿瘤细胞凋亡而对大多数正常组织细胞无损害，有希望成为一种新的抗肿瘤药物。本研究采用用TRAIL联合应用化疗药物5氟脲嘧啶(5FU)共同作用胆管癌细胞，探讨TRAIL与化疗药物5FU联合治疗胆管癌细胞的可行性及相互关系，为胆管癌综合治疗提供依据。

　　1材料与方法

　　1.1实验仪器与试剂胆管癌细胞株QBC939，由第三军医大学西南医院肝胆外科中心建株惠赠[2]，是一株来源于人肝门部的低分化腺癌;优质胎牛血清和RPMI 1640培养液(Gibco BRL公司,美国)产品;5FU和胰蛋白酶(Sigma公司产品,美国)。TRAIL(Pepro Tech EC LTD,美国)。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养在37℃、5%CO2条件下，以含10%优质胎牛血清、青霉素10万U/L和链霉素10万U/L的RPMI 1640培养液中对人肝外胆管癌细胞系QBC939中进行传代培养。

　　1.2.2细胞生长抑制率的测定采用四氮唑蓝快速比色(MTT)法测定细胞生长抑制率，将处于对数生长期的QBC939细胞，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，每孔10 000个细胞接种于96孔培养板中,细胞贴壁后，TRAIL单独用药组分别加入1、10、100、1 000 ng/ml TRAIL。TRAIL+5FU联合用药组分别加入1、10、100、1 000 ng/ml TRAIL及10 mmol/ml 5FU。每组3复孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，实验终止前4 h，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 ml，继续培养4 h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 ml二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，在550 nm处测定各孔的吸光度值(A550 nm)。各用药组细胞生长抑制率IR(%)=(1-用药组A550 nm/对照组A550 nm)×100%。

　　1.3统计学处理采用SPSS11.0统计软件包处理数据，组间细胞抑制率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　TRAIL作用24 h后，对QBC 939细胞生长的抑制作用呈明显的浓度依赖性，5FU加强TRAIL对胆管癌细胞QBC939的抑制作用。1、10、100、1 000 ng/ml TRAIL单独用药组QBC939细胞抑制率分别为15.6%、31.2%、37.5%、40.6%,而1、10、100、1 000 ng/ml TRAIL+5FU联合用药组QBC939细胞抑制率分别为46.9%、62.4%、68.7%、78.1%,联合用药组对QBC939细胞抑制率明显高于单独用药组(P<0.05)。

　　表1TRAIL单独用药与TRAIL+5Fu联合用药对QBC939细胞抑制率的比较(略)

　　3讨论

　　在哺乳动物中,生长和静止保持动态平衡,主要依靠凋亡实现,有益的凋亡在消除免疫反应后活化的淋巴细胞和祛除病毒感染的细胞及肿瘤转化细胞发挥重要的生理功能。由于死亡受体能引起许多肿瘤细胞凋亡，因此，在肿瘤治疗方面具有很大潜能。　　TRAIL是肿瘤坏死因子超家族的新成员，与受体结合的膜外区与Fas同源性为23.2%，与TNF同源性为19%。目前已知其受体主要有死亡受体DR4、DR5和诱捕受体DcR1，DcR2及调节骨密度受体 OPG。TRAIL与DR4、DR5结合后，能激活一系列酶级联反应而引起靶细胞的凋亡，而DCR1和DCR2由于其在细胞内是缺如或截断的，与TRAIL结合后不能诱导靶细胞的凋亡。由于大多数肿瘤组织高表达DR4和DR5而低表达或不表达DCR1和DCR2，故TRAIL能与DR4或和DR5结合，引起肿瘤细胞的凋亡，起到抗肿瘤的作用。而大多正常组织高表达DCR1和DCR2，能竞争结合TRAIL，使正常组织不会受到损害[3] ，段永亮等[4]研究证实，在体外TRAIL能选择性诱导肿瘤细胞凋亡，同时也发现一些肿瘤对TRAIL的作用是不敏感的，但是这些肿瘤细胞通过化疗药物，细胞因子(如肿瘤坏死因子)刺激后又对TRAIL的治疗敏感，如果是本身就对TRAIL作用敏感的肿瘤细胞，通过加入细胞因子或化疗药物后，能够起到协同加强治疗作用[5]。5FU可通过诱导肿瘤细胞凋亡而使其主动性自杀性死亡，其半衰期短为10 min 20min,而限制其发挥效能[6],临床有效率仅为20%～30%[7]，但目前仍是消化道恶性肿瘤化学治疗的首选药物。Wu等[8] 研究发现，p53能诱导TRAILR2/DR5基因的转录，5FU能上调DR5 mRNA的表达，提示活化p53的药物与TRAIL联合应用，可能会更有效地使某些肿瘤退化，克服肿瘤细胞抗凋亡蛋白的抑制作用。最近的研究发现无论是体内还是体外实验5FU均能加强TRAIL的抗肿瘤作用。目前尚无对胆管癌治疗有效的方案,虽然5FU作为一种基本的化疗药物经常使用于不能切除的胆管癌，但是其作用可能不足10%。即使与丝裂霉素C和阿霉素三者联合应用其作用也不足30%，并且比起单独使用5FU毒性明显增加[9]。本研究发现，单独应用TRAIL能够诱导胆管癌细胞凋亡， 随着TRAIL作用浓度的增加，凋亡越明显，呈剂量依赖性。每组加入5FU(10mmol/ml)与单独应用TRAIL组比较均明显的加强对QBC939肿瘤细胞的抑制作用。不同TRAIL浓度TRAIL 单独用药组与TRAIL+5FU联合用药组比较有差异。P<0.05 由此可见，TRAIL可通过诱导胆管癌细胞凋亡而起到抑癌作用，而化疗药物5FU能加强TRAIL的抗癌活性。两者联合使用可增加5FU的抗肿瘤效果。

　　【参考文献】

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　　[5]Langaas V, Shahzidi S, Johnsen J, et al. Interferongamma modulates TRAILmediated apoptosis in human colon carcinoma cells[J]. Anticancer Res, 2001,21:37333738.

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　　[8]Wu GS, Burns TF, McDonald ER, et al. KILLER/DR5 is a DNA damageinducible p53regulated death receptor gene[J]. Nat Genet ,1997,17:141143.

　　[9]Oberfield RS, Rossi RL. The role of chemotherapy in the treatment of bile duct cancer[J]. World J Surg , 1988,12:105.