重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2对大鼠移植肝缺血/再灌注损伤的保护作用

　　作者：庞利群 作者单位：徐州医学院附属淮安医院普外科，江苏淮安223002

　　【摘要】 目的 探讨重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2对大鼠移植肝缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。方法 重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2通过门静脉注入实验组供体大鼠肝脏，术后36 h剖腹获取供肝，并将其保存在4℃乳酸钠林格液中4 h，“双袖套法”行原位肝移植术。门静脉复流6 h后观测受体胆汁分泌情况，处死受体大鼠，检测血浆中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酸(LDH)水平，肝脏组织中Bcl-2和TNF-α表达，TUNEL法检测肝脏组织的细胞凋亡，电镜观察肝脏组织的亚细胞结构变化。结果 术后6 h，免疫组化和 Western blot检测显示，与对照组相比实验组肝脏组织中Bcl-2表达明显升高，胆汁分泌量增加， AST、ALT、LDH水平明显降低， TNF-α表达显著增高。实验组细胞形态变化较轻，凋亡指数明显低于对照组。结论 经门静脉转染的重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2在大鼠肝脏内能够有效表达，高表达Bcl-2能够降低移植肝的缺血/再灌注损伤。

　　【关键词】 肝移植 缺血 再灌注损伤 基因转染 Bcl-2 大鼠

　　Protective effect of recombinant adenovirus vectors Ad.VSG-hBCL-2 on the

　　graft of rat liver transplantation against ischemia/reperfusion injury

　　PANG Liqun1, FANG Pingceng2, LIU Dabiao2

　　(1.Department of General Surgery, the Huai′an Hospital Affiliated to Xuzhou Medical College, Huai′an,

　　Jiangsu 223002, China; 2.Department of General Surgery, the Fourth People′s Hospital of Zhenjiang

　　Affiliated to Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212000)

　　Abstract:Objective To study the protective effect of recombinant adenovirus Ad.VSG-hBCL-2 on the graft of liver transplantation against ischemia/reperfusion injury in rats.Methods The donor rat′s liver was first treated by injecting the recombinant adenovirus Ad.VSG-hBCL-2 via the portal vein. 36 hours later, the donor rat was re-laparotomized to remove the graft liver. The graft was preserved in 4℃ Ringer′s lactate solution for 4 hours before the rat orthotopic liver transplantation (ROLT) was performed using the cuff technique. Six hours after that, the relevant liver function parameter were assayed.Results It was found that the bile flow was increased in the test group rats, compared to that of the control. Immunohistochemical analysis and Western blot assay showed that Bcl-2 was overexpressed in the treated graft liver. Blood tests showed the mean levels of ALT, AST and LDH were significantly lower in the transfected liver tissue than that in the control. Immunohistochemistry showed higher level of TNF-α in the control liver graft. The cell morphology changes were milder and the apoptosis index was lower in the transfected graft livers than in the control.Conclusion Being administered via the portal vein, the recombinant Ad.VSG-hBCL-2 can be expressed in rat livers. And in vivo, the overexpression of Bcl-2 can reduce the subsequent ischemia/reperfusion injury in the graft liver.

　　Key words: liver transplantation; ischemia/reperfusion injury; gene transfer; Bcl-2; rat

　　肝细胞凋亡是移植肝缺血/再灌注损伤的主要机制[1]。在器官移植前，将外源性凋亡抑制基因转染入移植物，并表达功能性蛋白，以抑制供肝的细胞凋亡，从而减轻手术后移植肝的缺血/再灌注损伤，对提高移植肝存活时间和改善肝功能等方面具有重要意义。我们以改良“双袖套法”建立大鼠原位肝移植模型，应用重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2转染供体肝脏，观测Bcl-2在大鼠肝脏组织中的表达及其在大鼠原位移植肝缺血/再灌注损伤中的保护作用，为探索移植肝缺血/再灌注损伤的保护方法提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂 重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2(上海第二军医大学基因实验室)， LipofectAmine2000试剂盒(Gibco BRL公司)，鼠抗人HBCL-2单克隆抗体Stressgene： SPA810(人、鼠、兔共享)，兔抗鼠TNF-α(Santa Cruz公司)，免疫组化试剂盒(博士德公司)， TUNEL试剂盒(Roch公司)， Western Blot检测试剂盒(NEB公司)。

　　1.1.2 引物合成 采用PCGENE软件中的PCRPLAN程序，由基康基因公司合成。 h-BCL-2基因上游引物： VT369 5′-GGAGATAGTGATGAAGTAC-3′。 h-BCL-2基因下游引物： VT370 5′-AGAGACAGCCAGGAGAAAT-3′。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物及分组 健康雄性SD大鼠220～250 g，共56只。取48只配成24对，随机分成3组，每组8对，余8只为正常组。① 正常组：只取肝脏及血液检测各项观察指标值，不做肝移植。② A 组： Ad.VSG-hBCL-2预处理供体。③ B组：病毒空载体Ad-EGFP预处理供体。④ C组：0.9%氯化钠溶液预处理供体。

　　1.2.2 供体处理方法 A组(Ad.VSG-hBCL-2体内转染预处理供体大鼠 )：①术前12 h禁食、4 h禁饮水，氯胺酮腹腔麻醉(80 mg/kg)。② 麻醉成功后上腹部正中切口入腹，将肠管推向左下腹，显露门静脉及肠系膜静脉。③ 细针穿刺肠系膜静脉，缓慢注射Ad.VSG-hBCL-2悬液(1.5×1012 pfu/L)2 ml，压迫止血1 min后关腹。④ 麻醉清醒后1 h，自由饮水、进食。

　　B组：病毒空载体Ad-EGFP悬液(1.5×1012 pfu/L)2 ml预处理供体大鼠，方法同A组。

　　C组：0.9%氯化钠溶液 2 ml预处理供体大鼠，方法同A组。

　　1.2.3 受体处理方法及标本采集 A组：① Ad.VSG-hBCL-2预处理供体大鼠36 h后获取供肝称重(g)，以乳酸钠林格液灌注保存，冷缺血时间为4 h。②采用“双袖套法”行原位肝移植术[2]，受体门静脉复流6 h后麻醉进腹，于胆总管内置入硬膜外麻醉用导管，根据导管中胆汁的长度推算每分钟的胆汁分泌量，再除以供肝的质量，即为每分钟每克肝脏的胆汁分泌量(μg·min-1·g-1)。硬膜外导管测量胆汁分泌量的方法：向胆总管近端插入硬膜外导管，测量每分钟胆汁引流的导管长度。导管体积测定：用微量注射器向导管内注入50 μl有色液体测量其长度，共6次，计算得1 mm=(0.65±0.26)μl。③从肝下下腔静脉抽血1.0 ml，检测天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酸(LDH)。④切取肝左叶，置入液氮保存，备检Western blot。 切取肝右前叶，置入10%甲醛，石蜡包埋后备检免疫组化及TUNEL。取肝右前叶，置入4%戊二醛溶液固定，送电镜室观察。

　　B组和C组的处理及标本采集方法同A组。

　　1.2.4 标本检测 生化检测血浆中AST、ALT、LDH水平，Western blot检测大鼠肝组织Bcl-2表达，免疫组化方法检测肝组织中Bcl-2和TNF-α 表达，TUNEL法检测肝组织的细胞凋亡，电镜观察肝组织的亚细胞结构变化。

　　1.2.5 细胞凋亡指数及免疫组化定量分析 ①采用Image-Pro Plus图像分析软件，切片组织在400倍光学显微镜放大下，摄取图像并输入分析系统，选择并测量染色阳性面积与视野面积。每张切片随机选5个视野，将Bcl-2及TNF-α表达的阳性面积除以视野面积(%)，取其均值为“阳性区域面积”。②凋亡指数：光镜下每例标本切片随机选取5个400倍视野，计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，以百分数表示为凋亡指数(apoptotic index， AI)。

　　1.3 统计学处理 数据以±s表示，采用SAS统计软件包进行方差分析及两两比较，检验水准:α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 胆汁分泌量 门静脉复流6 h后测定胆汁分泌量，A组与B组、C组相比较明显增加，差异有统计学意义(P<0.01);B、C两组间胆汁量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。A组与正常组胆汁量比较其差异亦有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　2.2 各组血ALT、AST、LDH的检测 A组门静脉复流6 h后，血清ALT、AST、LDH均明显低于B组及C组，差异有统计学意义(P<0.01)。B、C两组间各项指标比较，差异无统计学意义。A组与正常组肝功能比较亦有统计学意义(P<0.01)。见表2。表1 门静脉复流6 h后胆汁分泌量表2 各组术后6 h肝功能比较与正常组比较：*P<0.01;与A组比较：#P<0.01

　　2.3 大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达 Western blot检测，正常组大鼠肝脏组织不表达Bcl-2蛋白，B组及C组大鼠肝脏组织仅痕量表达Bcl-2蛋白，A组(Ad.VSG-hBCL-2治疗组)大鼠肝脏组织Bcl-2蛋白表达明显。见图1。

　　图1 复流6 h后各组肝组织内Bcl-2的表达

　　2.4 免疫组化及细胞凋亡检测

　　2.4.1 Bcl-2蛋白的表达 正常组大鼠肝脏细胞Bcl-2蛋白无明显表达。A组大部分肝细胞胞质染成棕黄色，而B、C组肝细胞偶见弱阳性表达，A组与B、C组阳性表达百分率比较差异有统计学意义(P<0.01)，B组与C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

　　2.4.2 TNF-α的表达 正常组大鼠肝脏未见表达。B组及C组可见大量肝细胞及窦内皮细胞染成棕黄色，A组仅在少数局部范围可见淡棕黄色的弱阳性细胞，A组与B、C组阳性表达百分率比较有统计学意义(P<0.01)，B组和C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

　　2.4.3 细胞凋亡及AI 正常大鼠肝脏偶见凋亡细胞。门静脉复流6 h后TUNEL法检测移植肝细胞凋亡，A、B、C组都可见细胞核呈棕色的凋亡细胞，但是A组肝细胞凋亡明显少于B、C组。A组与B、C组AI比较差异有统计学意义(P<0.01)，B组与C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。表3 各组受体术后6 h肝组织Bcl-2、TNF-α及AI比较 与正常组比较：*P<0.01;与A组比较：#P<0.01

　　2.6 肝组织病理形态学变化 透射电镜观察A组细胞器结构完整，线粒体排列整齐，无明显改变，偶见有粗面内质网扩张。B组肝细胞线粒体肿胀，胞质疏松，溶酶体增多，细胞核内染色体边聚，肝细胞膜和核膜变形，可见凋亡细胞及凋亡小体。C组与B组病理变化基本相同。

　　3 讨 论

　　3.1 细胞凋亡的调控基因及Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用 目前研究表明[3]，移植后早期细胞凋亡是导致肝脏保存再灌注损伤的重要原因。凋亡不但见于肝细胞，也见于胆管上皮细胞及血管内皮细胞。细胞凋亡导致的肝脏实质细胞丧失，可以延迟移植器官恢复功能的时间，严重者将导致移植物早期无功能和肝功能衰竭。

　　缺血/再灌注损伤诱导的肝细胞凋亡与线粒体功能损害和能量代谢障碍、氧自由基生成、细胞内钙超载以及大量细胞因子(TNF-α、IL-8)产生等因素密切相关[4]。不同的病理因素引起的细胞凋亡受P53、Fas、Myc、Bcl-2家族等因子的调控，受体介导是肝细胞凋亡的最主要途径，对细胞凋亡的抑制性调控作用，也意味着有效的保护移植肝的缺血/再灌注损伤，乃至进一步减轻移植器官的急性或慢性排斥反应[ 5-6]。由于Bcl-2基因处于凋亡调控的终末部分，其表达蛋白可减少氧自由基产生和脂质过氧化物的形成，抑制Ca2+ 的跨膜流动和抑制凋亡蛋白酶(caspase)的激活及其稳定细胞器的功能，从而阻止多种因素介导的细胞凋亡，因此是人体内最重要的抗凋亡基因[7]。

　　3.2 Bcl-2基因转染预处理及其在移植肝缺血/再灌注损伤中的保护作用 鉴于Bcl-2在细胞凋亡调控作用中的重要地位，近年来有很多的关于其在肿瘤中作用的研究报道[8]，但是在器官移植中Bcl-2用于基因转染治疗的研究，近10年来的相关文献仅有极少量报道。Bilbao等[9]用微血管钳阻断部分肝叶血管，以建立肝缺血/再灌注模型进行研究，结果发现，Bcl-2基因具有保护移植肝的作用。但是，由于阻断肝脏血管的时间很短(20～40 min)，在正常情况下不可能引起严重的肝缺血/再灌注损伤，而且缺血/再灌注损伤的发生不仅与其缺血后再复流引起的损害有关，同时还与门静脉血流阻断后发生一系列病理变化有密切的联系[10]，因此对供体预处理以研究缺血/再灌注损伤的机制及其保护效果，建立动物的原位肝移植模型应更为合理。

　　我们通过大鼠原位肝移植模型研究供体肝脏经过较长的冷缺血时间和移植后的再灌注损伤，经门静脉转染的Bcl-2基因能够有效表达，术后肝功能损害明显减轻，亚细胞形态基本正常，结果提示Bcl-2基因表达的功能蛋白对移植肝脏具有显著保护作用。

　　此外，我们还发现，正常肝脏组织不表达Bcl-2，但是在对照组(B、C组)Bcl-2有痕量表达，提示肝组织在缺血/再灌注损伤时可能通过调控凋亡抑制基因Bcl-2的表达而对细胞损伤起一定的自身保护作用。这一发现表明，转染携带Bcl-2基因的重组腺病毒预处理供体以保护移植肝脏，符合机体在损伤情况下的生理调节机制。

　　【参考文献】

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