内皮抑素的表达与直肠癌侵袭行为的关系

　　作者：盛薇，王康，王虎霞，魏光斌，李徐奇 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院普外科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 研究内皮抑素(ES)与直肠癌血管形成的关系，探讨其在直肠癌侵袭行为中的作用。方法 应用免疫组化方法，检测10例正常直肠组织与40例直肠癌组织中ES蛋白的表达以及微血管密度(MVD)。结果 ES在正常直肠组织中的表达明显高于直肠癌组织(P<0.05)。随直肠癌浸润深度的增加及淋巴结转移的发生，组织中ES蛋白的表达与MVD呈负相关关系(P<0.05)。结论 ES表达降低，肿瘤血管生成增加，MVD升高，可促进直肠癌的局部浸润及淋巴结转移。

　　【关键词】 内皮抑素;微血管密度;直肠癌

　　Relationship between endostatin expression　and the invasion of rectal cancer

　　Sheng Wei, Wang Kang, Wang Huxia, Wei Guangbin, Li Xuqi

　　(Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the relation of endostatin (ES) and the vascular formation in rectal cancer, and the effect of ES on the invasion of rectal cancer. Methods The expression level of ES and microvessel density (MVD) in 10 cases of normal rectal tissues and 40 cases of rectal cancer were detected by immunohistochemistry staining. Results The expression level of ES in normal rectal tissues was obviously stronger than that in rectal cancer (P<0.05). There was a negative relation between the expression level of ES and MVD in rectal cancer with the changes of the depth of infiltration and lymph node metastasis (P<0.05). Conclusion With the decrease of ES, the number of knubbly vessels increases. The decrease of ES can promote infiltration of rectal cancer and metastasis of lymph node.

　　KEY WORDS: endostatin; microvessel density; rectal cancer

　　新近研究表明，血管生成在恶性肿瘤的生长、侵袭及转移中具有重要作用，血管生成的启动是肿瘤微环境中血管生成刺激因子和抑制因子平衡改变的结果。内皮抑素(endostatin, ES)是近年来发现的抑制肿瘤血管生成的一种细胞因子，为ⅩⅧ型胶原C末端的184个氨基酸片段，能通过诱导内皮细胞的凋亡、阻断血管内皮生长因子的作用、抑制基质金属蛋白酶活性等多种途径抑制新生血管生长，进而抑制肿瘤生长和转移[1]。肿瘤微血管密度(microvessel density, MVD)是判断肿瘤血管生成的定量指标[2]。本研究通过检测直肠癌组织中ES蛋白的表达与MVD，探讨 ES与直肠癌血管形成的关系以及在直肠癌侵袭行为中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 选取我院1999-2002年间直肠癌切除术后的石蜡包埋组织40例，其中男性16例、女性24例，年龄20-75岁，平均年龄55岁。正常直肠组织10例为对照。按Dukes分期A期7例，B期15例，C期18例。

　　1.2 检测方法 采用免疫组织化学SP法。鼠抗人ES单克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体和免疫组织化学染色试剂盒(SP kit) 均购自福州迈新公司。按试剂盒说明书所示步骤进行操作。

　　1.3 结果判定 ES阳性表达主要定位于细胞核或细胞浆，呈棕黄色。依据高倍镜视野下(×400)阳性细胞数所占比例进行评分。1分：阳性细胞≤5%;2分：阳性细胞为5%-20%;3分：阳性细胞为21%-50%;4分：阳性细胞>50%。MVD的测量方法：在高倍镜视野下(×400)随机计数5个视野的被CD34染成棕黄色的血管数目，取其平均值作为MVD，每一个与邻近的微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或内皮细胞簇均视为独立的微血管。

　　1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，实验数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，相关分析采用秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 正常直肠组织与直肠癌组织中ES的表达及MVD ES阳性表达主要在正常直肠黏膜组织。直肠癌组织中边缘区细胞ES染色要强于中心区，一些坏死组织周边区也可见到强阳性染色出现。直肠癌组织的MVD明显高于正常黏膜组织(P<0.05，表1)。

　　表1 正常直肠组织与直肠癌组织中ES 的表达及MVD(略)

　　Table 1 The expression level of ES and MVD in normal rectal tissues and rectal cancer

　　*P<0.05 vs. normal rectal tissue

　　2.2 直肠癌组织中ES的表达、MVD与临床病理特征的关系 依癌组织浸润深度分为黏膜层、肌层、全层三组，随浸润深度的增加，直肠癌组织中ES表达与MVD呈负相关关系(rs=-0.786, P<0.05)。直肠癌浸润越深，ES蛋白的表达越低，而MVD增加(表2)。

　　表2 直肠癌的浸润深度与ES表达及MVD的关系(略)

　　Table 2 The effect of the expression level of ES and MVD on the depth of infiltration in rectal cancer

　　△P<0.05 vs. mucous membrane; *P<0.05 vs. mucous membrane and muscular layer

　　2.3 直肠癌组织中ES的表达、MVD与淋巴结转移的关系 按淋巴结转移情况分为有淋巴结转移与无淋巴结转移两组，两组间直肠癌组织中ES表达及MVD有显著性差异(P<0.05，表3)。

　　表3 淋巴结转移与ES表达及MVD的关系(略)

　　Table 3 The effect of the expression level of ES and MVD on the lymph node metastasis in rectal cancer

　　*P<0.05 vs. no lymph node metastasis

　　3 讨论

　　肿瘤从静止状态发展到伴随血管新生的浸润状态，其关键在于血管形成因子与血管形成抑制因子之间平衡状态的改变[3]。在肿瘤组织中正是因为这种平衡状态受到破坏，诱发新生血管的形成，构成了肿瘤发生发展的病理基础。20世纪90年代初，Folkman[4]发现实体肿瘤的发生、生长、浸润以及转移均依赖于新生血管的形成。肿瘤血管生成的启动是多种因素的共同结果，通常是血管抑制调节因子失活或缺失，血管生长刺激因子从基质中释放并作用于内皮细胞的结果。近年来有关大肠癌血管形成因子的报道较多，包括成纤维生长因子、血管内皮生长因子等[5]。多数研究显示肿瘤微血管生成与大肠癌的Dukes分期、淋巴结转移及预后等均有较密切的关系[6]。同时，许多恶性肿瘤也分泌血管生成抑制因子，包括血管抑素和血小板凝血酶敏感蛋白等。ES是一种特异的内皮细胞增殖抑制剂，具有很强的抑制血管生成的作用[7]，可通过诱导肿瘤血管内皮细胞凋亡从而提高肿瘤细胞的凋亡速率。此外，它还通过其他途径抑制肿瘤血管的生成，如直接抑制血管生长和抑制血管内皮细胞增殖。ES特异性地抑制内皮细胞的增殖，其机制可能与内皮细胞凋亡的增加或细胞周期的改变有关[8]。ES通过抑制肿瘤血管的生长，导致肿瘤缺氧，从而促进肿瘤细胞坏死、凋亡[9]。本研究发现，直肠癌组织与正常直肠组织相比较，ES蛋白的表达明显减少，MVD显著增高。表明随着血管生成抑制因子分泌的减少，肿瘤组织血管生成增加，提示新生血管的形成有利于癌肿的发生。这与相关研究结果一致[3,10]。肿瘤血管的形成具有一定的组织侵袭性，肿瘤细胞可沿新形成血管开启的组织裂隙向外侵袭，侵蚀周围组织。微血管密度越高进入循环的瘤细胞数相对也较高,且这些肿瘤细胞在转移灶内诱发微血管形成的能力也较强，故微血管密度高的肿瘤易发生浸润、转移。对大肠癌的研究证实，MVD与大肠癌转移和复发有密切关系，MVD高的易发生转移或复发[1112]，5年生存率相对较低。Tanigawa[13]对133例大肠癌患者研究发现生存率超过6年的MVD均值是96±41，死于术后复发的MVD为133±45。用Cox风险模型多因素分析显示MVD是有价值的独立预后因素，进一步研究表明MVD与大肠癌血源性转移相关。MVD是大肠癌生物学行为重要相关因素，可预测患者转移和早期死亡。Tomisaki[14]对175例原发性大肠癌研究也认为MVD高的患者有血源性转移倾向,易发生肝转移。本研究发现，在直肠癌组织中，随肿瘤浸润深度的增加及淋巴结转移发生，ES表达降低，MVD升高，ES表达与MVD呈负相关关系。表明ES下调引起微血管的形成，MVD升高，进而促进肿瘤的浸润与转移，在直肠癌侵袭过程中起着重要作用。提示直肠癌浸润、转移不仅与血管生成有关，同时亦与血管生成抑制因素有密切的关系。综上所述，我们可以推测，运用外源性ES来阻断肿瘤血管的生成，可以起到抑制直肠癌肿瘤组织生长和转移的作用。有报道用外源性的ES治疗膀胱癌[15]、结肠癌[16]和胃癌[17]等恶性肿瘤，临床实验结果表明能明显缩小肿瘤，并能阻止癌细胞的转移。随着研究的深入，ES可能在直肠癌的基因治疗方面发挥一定的作用，用其配合常规的手术、化疗、放疗和免疫治疗,将会进一步提高肿瘤的治疗效果。

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