树突状细胞对裸鼠结肠癌移植瘤的抗癌效应

　　作者：贺子彪，杨伟明，焦保庭，宋 辉 作者单位：遵义医学院附属医院普外科，贵州遵义 563003

　　【摘要】 目的 研究结肠癌患者外周血树突状细胞(DC)体外诱导后在裸鼠体内的抗癌效应。方法 通过皮下移植法建立裸鼠模型，按治疗次数分为对照组、治疗组和加强组;从患者外周血中分离并培养出DC，以肿瘤抗原和金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激DC;DC激活同源T淋巴细胞;DC激活的T淋巴细胞经用该患者结肠腺癌细胞建立的裸鼠模型的尾静脉注入，观察成瘤时间、肿瘤生长情况、移植肿瘤大小及裸鼠摄食、活动状况。结果 成功建立结肠癌裸鼠模型。肿瘤接种第60天，对照组、治疗组及加强组肿瘤大小分别为(3899±22)mm3、(1301±16)mm3、(392±18)mm3。与对照组相比，治疗组及加强组移植瘤生长均受到抑制(P=0.000);与治疗组相比，加强组移植瘤生长抑制更明显(P=0.000)。结论 同源结肠癌患者外周血DC和T淋巴细胞共孵后能抑制裸鼠体内移植瘤的生长。这有可能为肿瘤治疗提供一种新的方法。

　　【关键词】 树突细胞;结肠癌;免疫疗法;裸鼠;抗癌

　　(Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China)ABSTRACT: Objective To study the immune response of dendritic cells (DC) modified with tumor antigen and SEB to transplanted tumor in nude mice. Methods Nude mice models were established with human colon cancer cells inoculated subcutaneously, grouped into control group, therapy group and retherapy group; DC was isolated and purified from PBMC of colon carcinoma patient to activate T lymphocyte with DC modified by tumour antigen and SEB. The T lymphocyte was implanted to the models to inhibit the growth of implanted tumor through tail vein. Tumor formation, growth and size, nude mice feeding and activity status were observed. Results The subcutaneously xenotransplanted tumor model of human colon carcinoma in nude mice was successfully established. After colon cancer cells had been inoculated in nude mice for 60 days, volume of transplanted tumor in the control group was (3899±22)mm3, therapy group (1301±16)mm3, and retherapy group (392±18)mm3. Compared with the control group, the tumor in therapy group and retherapy group could grow slowly (P=0.000). Compared with that in the therapy group, the tumor growth in retherapy group became obviously slower (P=0.000). Conclusion The immune response induced by DC can inhibit the growth of transplanted tumor in nudes mice, which may provide a new therapy for tumor.

　　KEY WORDS: dendritic cell; colon carcinoma; immunotherapy; nude mouse; antitumor

　　树突状细胞(dendritic cell, DC)在诱导宿主对肿瘤高效而特异的细胞免疫反应中起关键作用[1]。肿瘤患者体内往往存在DC功能缺陷[2]，无法有效地递呈肿瘤抗原给T淋巴细胞，造成了免疫忽视或免疫逃逸。本研究以同源结肠癌患者的DC诱导T淋巴细胞，观察其能否抑制裸鼠体内同源结肠癌移植瘤生长。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 4周龄BALB/c裸鼠30只，体重21～23g，皆雌性，购于北京维通里华公司，饲养于SPF级实验室。

　　1.2 结肠癌裸鼠模型的建立及分组 取对数生长期结肠腺癌细胞，调细胞密度至5×105个/mL，每只裸鼠皮下注射0.2mL该细胞悬液建立裸鼠模型，共30只[3]。裸鼠模型接种腺癌细胞第7天，随机选择20只裸鼠予尾静脉注射T淋巴细胞[1×107个/(2mL·只)]做治疗(治疗组)，10只以生理盐水(2mL/只)注射作为对照(对照组)。接种第30天时，再于治疗组20只裸鼠中随机选10只以T淋巴细胞[1×107个/(2mL·只)]做加强治疗(加强组)，另10只以生理盐水注射作为对照。所使用的DC、T淋巴细胞和腺癌细胞均来自同一患者。每2d观察一次上述各组移植瘤生长的情况，包括移植瘤是否生长及其大小，裸鼠饮食及活动，接种第60天结束实验。肿瘤大小记录为：体积(mm3)=长(mm)×宽2(mm2)/2。

　　1.3 培养肿瘤细胞 经原代培养法获结肠癌细胞[4]。

　　1.4 制备肿瘤抗原 冻融法获结肠癌细胞抗原，过滤备用[5]。

　　1.5 分离和培养T淋巴细胞 分离外周血并过滤获T淋巴细胞，37℃、5%(体积分数)CO2、100%湿度的细胞培养箱内培养，每2d更换半量新鲜细胞培养液(RPMI 1640+10% FCS)[6]。

　　1.6 培养和鉴定DC，激活T淋巴细胞 收集分离T淋巴细胞步骤中的黏附细胞，加DC培养液[细胞培养液+100μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)+10μg/L白细胞介素4(IL4)]，37℃、5%(体积分数)CO2、100%湿度的细胞培养箱内培养，每2d更换半量新鲜DC培养液，培养至第5天加入肿瘤抗原(按肿瘤细胞数与DC数比例为3∶1)和金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)(100μg/L)。修饰36h后将其与T淋巴细胞按1∶100的比例置37℃、5%(体积分数)CO2、100%湿度的细胞培养箱内再培养36h，即得本研究所需的效应细胞。其中黏附细胞培养到第5天和第7天(修饰前后)，各取细胞5×105个，用FCM分析其表达DC特异分子CD11c、CD80、HLADR的情况，并取修饰后的细胞做电镜观察[6]。

　　1.7 统计学处理 实验结果以均数±标准差(±s)表示。应用SPSS13.0软件行方差分析和t检验，以P<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 三组裸鼠模型移植瘤的生长状况 对照组10只中有8只在第8天见米粒大少的皮下肿瘤长成，肿瘤生长较快;治疗组与加强组共20只中14只在第16天，才见米粒大少的皮下肿瘤出现，肿瘤生长慢，加强组注射T淋巴细胞后持续1周左右，移植瘤生长明显平缓。到实验结束，裸鼠活动及饮食未见明显异常，各组移植瘤呈结节性膨胀性生长，未见移植瘤周围及其他部位明显转移病灶，无裸鼠死亡。实验结束后取肿瘤制片行HE染色及CEA、CK20等免疫组化法再次检验，均呈阳性[5]。

　　2.2 T淋巴细胞对移植瘤生长的抑制作用 肿瘤接种第60天，对照组、治疗组及加强组肿瘤大小分别为(3899±22)mm3、(1301±16)mm3、(392±18)mm3。与对照组相比，治疗组及加强组移植瘤生长均受到不同程度抑制(P=0.000);与治疗组相比，加强组移植瘤生长抑制更明显(P=0.000，图1～图3)。

　　3 讨 论

　　DC是体内最强的专职性抗原递呈细胞和免疫应答的始动者。本实验在成功地建立了原代培养人结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型后[3],以SEB和同源肿瘤抗原修饰DC激活的T淋巴细胞作为效应细胞来治疗裸鼠结肠癌移植瘤,能产生明显的抗肿瘤效应。机体主要依靠特异性细胞免疫杀伤肿瘤细胞。有关DC诱导T淋巴细胞抗肿瘤的机制可能为：DC活化后释放IL12，刺激辅助性T细胞(Th0)向Th1分化，且使T淋巴细胞活化增殖，DC摄取肿瘤抗原，通过交叉递呈激活T淋巴细胞，激发特异性细胞免疫应答[7]，产生主要组织相容性复合体(MHC)限制性细胞毒作用，杀伤表达相应肿瘤抗原的肿瘤细胞。

　　本研究结果显示，治疗组和加强组裸鼠移植瘤生长明显缓慢。这是由于DC诱导的抗肿瘤免疫反应所致，且不同于一般过继性免疫治疗，是以肿瘤抗原和SEB修饰DC而引起的主动免疫反应。以其修饰DC可简便有效的获得针对原发肿瘤多种抗原的多价DC瘤苗。分析两治疗组肿瘤生长曲线我们发现，注射T淋巴细胞后持续1周左右，移植瘤生长明显平缓，与效应细胞的生存时间一致。由于所用细胞均来自同一结肠癌患者，裸鼠体内不具备效应细胞继续增殖的环境，其在裸鼠体内仅能维持一定的时间，所以在裸鼠体内发挥抗癌作用的时间是有限的。本研究结果提示，如果把经GMCSF和IL4联合培养，经肿瘤抗原和SEB修饰的DC回输给该肿瘤患者，可能在患者体内诱导出抗肿瘤的T淋巴细胞，能发挥较持久的生物活性。本实验以裸鼠为实验对象，但所用诱导细胞、效应细胞和靶细胞均来自同一结肠癌患者，实际上是通过裸鼠来进行的人体细胞实验，有利于进一步的人体实验研究。

　　结肠癌患者体内存在多种抑制DC功能的因素。恶性肿瘤细胞释放的IL10、血管内皮生长因子等通过抑制DC的成熟、下调DC共刺激因子的表达和促进DC的凋亡等方式[8]，抑制了DC递呈肿瘤抗原的能力。DC体外培养过程中,接触相应肿瘤抗原可被修饰，将这些肿瘤抗原修饰的DC回输体内，可诱导机体产生抗相关肿瘤抗原的免疫应答[9]。因此，在体外使用肿瘤抗原和SEB刺激不成熟DC成为成熟DC，再回输患者体内可能成为免疫治疗的新方法。但是，该法治疗效果受多种因索的影响，主要的影响因素可能有肿瘤本身的免疫原性及肿瘤分泌的免疫抑制因子等。治疗程序的安排也非常重要，因为回输的DC在体内有一定的寿命，要维持DC的体内抗肿瘤作用必需多次回输DC。总之，本实验表明，DC对肿瘤的治疗效果是肯定的，多次回输可使肿瘤的生长得到更有效的控制，为肿瘤治疗带来新的曙光。

　　【参考文献】

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　　[7]GUERMONPREZ P, SAVEANU L, KLEIJMEER M, et al. ERphagosome fusion defines an MHC class I crosspresentation compartment in dendritic cells [J]. Nature, 2003, 425(6956):397402.

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