雄激素受体与1型糖尿病胰腺β细胞增殖和凋亡的关系

　　作者：李如江，邱曙东，王海旭，田 宏，王丽蓉，霍涌玮 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院普通外科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 雄激素受体可介导广泛的细胞活动，如增殖、分化和凋亡等。本实验试图确认雄激素受体(AR)存在于胰腺β细胞内，并研究其在1型糖尿病发展过程中的作用。方法 多次低剂量链脲佐菌素(STZ)诱导形成小鼠1型糖尿病模型，分别于糖尿病第1天、第4周、第12周及第20周将模型鼠处死，同时设同龄正常对照。随着糖尿病的发展，以免疫荧光双标、免疫荧光三标、半定量RTPCR检测AR表达的改变，并了解和胰腺β细胞增殖与凋亡的关系。另外，在双氢睾酮(DHT)及DHT联合AR拮抗剂氟他胺(FLU)作用下体外培养原代β细胞，以进一步确定AR与胰腺β细胞增殖和凋亡的关系。结果 对照鼠及糖尿病第1天的STZ鼠，其AR mRNA和AR蛋白呈高表达，以后随着糖尿病的发展，其表达逐渐降低、乃至消失。TUNEL阳性的β细胞AR高表达，而Ki67阳性的β细胞AR低表达、甚至不表达。在体外细胞培养中，AR介导下β细胞凋亡指标较正常对照和DHT联合FLU组显著性增高;AR拮抗剂FLU作用下β细胞增殖指数较正常对照和DHT组显著性增高。结论 在正常鼠胰腺β细胞内AR高表达，随着1型糖尿病的发展，胰腺β细胞AR表达逐渐降低、乃至消失，AR表达的降低有助于抑制胰腺β细胞凋亡、促进胰腺β细胞增生

　　【关键词】 白藜芦醇;重症急性胰腺炎;肠黏膜屏障;ICAM1;VCAM1;丙二醛;TNFα;超氧化物岐化酶

　　重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)约占急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)的10%～15%左右，病情凶险，病死率高。感染和多器官功能衰竭是导致SAP患者死亡的主要原因。目前，对于SAP并发症的研究提示肠道在SAP后期的感染和并发症的发生中起到了重要作用。国内许多学者使用清胰汤及大黄等传统中药治疗急性胰腺炎，防止内毒素血症及保护肠道屏障，取得了满意的疗效[12]。我们的前期实验表明白藜芦醇(resveratrol, RES)具有较好的治疗SAP的作用[34]。本实验的目的是探讨RES在重症急性胰腺炎中对肠黏膜屏障的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 72只清洁级健康成年雄性SD大鼠，体重280～330g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供;牛磺胆酸钠，由美国Sigma公司;白藜芦醇，西安华萃生物工程公司提供;细胞内黏附分子1(intercellular adhesion molecule1, ICAM1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule1, VCAM1)免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购于武汉博士德;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒，由南京建成生物公司提供;125I肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factorα, TNFα)放射免疫分析测定盒，由中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所提供。

　　1.2 实验分组及SAP大鼠模型的制备 动物随机分为假手术(SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)组和白藜芦醇(RES)组，每组3、6、12h 三个时间点各8只。分组后分笼饲养，模型建立前12h禁食，自由饮水，室温维持在20～25℃。100mL/L水合氯醛(4mL/kg)腹腔内注射麻醉。常规消毒，SAP组经上腹正中切口入腹，提起十二指肠寻找胰胆管并以小号血管夹分别夹住十二指肠段和肝门部胰胆管。在肝门处用TB针(4.5号针头，1mL注射器)穿刺胰胆管逆行注射40g/L牛磺胆酸钠(1mL/kg)，持续2min，停留2min，然后拔除针头，去除血管夹，缝合腹壁。SO组打开腹腔，轻轻翻动十二指肠及胰腺组织后关腹。RES组于造模后5min将10g/L RES溶液(20mg/kg)通过阴茎背静脉给药。各组于造模后3、6、12h剖杀并收集标本。

　　1.3 标本的病理学观察 取回肠末端组织2cm(距回盲部10cm)，以40g/L多聚甲醛固定24h后作常规石蜡切片，HE染色观察肠道组织的病理改变。

　　1.4 血清TNFα的检测 取门静脉血2mL，分离血清，-20℃保存，测定前置冰水中复融，混匀后，4℃，3000g离心5min，取上清液用免疫放射法测定TNFα的水平。

　　1.5 肠道组织SOD和MDA的检测 距回盲部12cm取5cm回肠组织，制备组织匀浆，4℃，3000g离心15min。取上清，采用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法分别测定MDA水平和SOD活力。

　　1.6 肠道黏膜 ICAM1与VCAM1的检测 取甲醛固定的回肠组织，石蜡包埋，免疫组化SAB法检测回肠组织ICAM1和VCAM1的表达。切片灰度扫描判断表达量的多少。

　　1.7 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，全部数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 胰腺和回肠组织的病理学改变 SAP组大鼠3、6h肉眼可见腹腔内少量血性腹水，胰腺充血、水肿。12h胰腺明显肿胀，伴有黄色胶冻状半透明物，分叶结构模糊;小肠肠管扩张，肠壁呈暗红色，充血水肿明显，蠕动较差;与SAP组比较，RES组肉眼可见腹水明显减少，胰腺腺体充血，水肿较轻，分叶结构清楚;小肠肠管充血水肿减轻，蠕动较好。SAP组光镜下可见回肠黏膜固有层充血、水肿，柱状上皮细胞坏死脱落，绒毛水肿增粗，高度缩短，排列紊乱，部分绒毛断裂、缺损;RES组较SAP组光镜下病理改变明显减轻，绒毛排列基本整齐，炎性细胞较少浸润，肠黏膜上皮及绒毛形态基本完整。

　　2.2 TNFα的测定结果 SAP组3、6、12h血清TNFα水平较SO组均明显升高(P<0.05);RES组各时间点TNFα水平均明显低于SAP组(P<0.05，表1)。

　　2.3 回肠组织SOD和MDA的测定结果 与SO组相比，SAP组MDA水平在各时间点都有明显升高(P<0.05);RES组各时间点MDA水平较SAP组明显降低(P<0.05)(表1)。SAP组与SO组相比，SOD活性在各时间点都有明显的降低 (P<0.05);RES组在各时间点较SAP组SOD水平明显升高(P<0.05，表1)。

　　2.4 肠黏膜ICAM1和VCAM1的免疫组化检测结果 在造模3h后，回肠组织ICAM1的表达上调，其染色主要在肠道的浆膜及固有层内，呈棕黄色，在肠道固有层内的血管内皮处可见到黄褐色线带(图1)。SAP组ICAM1灰度值在各时间点都明显低于SO组(P<0.05);RES组各时间点较SAP组ICAM1灰度值明显升高(P<0.05，表1)。

　　免疫组化显色见VCAM1染色于回肠固有层及其内的小血管内皮，呈棕黄色，小血管内皮可见线带染色(图2)。SO组VCAM1灰度值在各时间点都明显高于SAP组(P<0.05);SAP组在各时间点较RES组明显降低(P<0.05，表1)。表1 大鼠各时间点TNFα、MDA、SOD、ICAM1和VCAM1水平的变化

　　3 讨 论

　　肠道屏障是指肠道能防止肠腔内的有害物质如细菌和毒素穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环的结构和功能的总和，包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障和化学屏障。急性胰腺炎时，肠道血管强烈的收缩，造成肠黏膜的缺血再灌注损伤。本实验从SAP时肠道SOD和MDA的变化，以及白细胞黏附和炎症介质释放的角度出发，研究白藜芦醇对大鼠重症急性胰腺炎肠道的保护作用。

　　黏附分子在介导白细胞的黏附过程中起到了重要的作用，其最主要的是ICAM1和VCAM1。它们在静息的内皮细胞上呈低表达或不表达，在炎性细胞因子如TNF、白介素等的作用下其表达迅速上调。ICAM1可以在多种细胞上表达，内皮细胞上ICAM1是介导中性粒细胞和内皮细胞黏附、激活的主要黏附分子[5] 。FRIJIUS等[6]利用敲除ICAM1基因小鼠做成大脑中动脉闭塞模型，对脑梗死面积进行研究。结果表明，基因敲除小鼠脑梗死面积较对照组明显减少，与用抗体预处理达到了同样的效果。VCAM1除表达在血管内皮上，也在平滑肌细胞、骨髓基质等细胞表达，其受体VLA4表达在大多数单个核细胞上。VCAM1选择性地促进单核细胞的黏附。SAP发生后，白细胞过度激活导致大量炎症介质入血。其中，TNF是最为关键的炎症介质之一。它可使回肠固有层及其内小血管内皮细胞上的ICAM1和VCAM1表达上调，介导中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞与血管内皮细胞的黏附。这些白细胞，尤其是中性粒细胞通过“呼吸爆发”和脱颗粒作用，直接造成肠黏膜上皮细胞的损害;同时，中性粒细胞大量聚集于毛细血管中，引起微循环阻塞，造成“无复流”现象，加重组织的缺血、缺氧，引起肠上皮细胞的损伤[78]。本实验中，RES明显抑制了ICAM1和VCAM1的表达，减少了炎症介质释放，从而减轻了肠道黏膜屏障的损伤程度。

　　SOD具有催化氧自由基的岐化作用。在病理情况下，氧自由基的产生超过了组织的清除能力，能使脂质过氧化。通过对肠黏膜SOD活性测定，可反应肠黏膜清除氧自由基的能力。MDA为病理情况下过剩的氧自由基攻击生物膜中的多种不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化的降解产物。测定组织中的MDA的含量，可以间接和可靠的反映组织脂质过氧化的程度。

　　本实验证实，RES不仅具有提高组织SOD活性，抑制脂质过氧化反应，而且能抑制TNFα的产生，下调ICAM1和VCAM1的表达，从而减少与白细胞的黏附，保护肠道黏膜的上皮细胞，减少了后期感染发生的机会。但是，RES对于下调ICAM1和VCAM1的表达是通过抑制TNFα的产生来实现的，还是直接抑制ICAM1和VCAM1的表达或是其他途径，尚有待于进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]吴咸中. 急性胰腺炎的中西医结合治疗 [J]. 世界华人消化杂志, 2001, 9(4):417418.

　　[2]吴承堂，藜沾良，黄祥成. 中药清胰汤及双歧杆菌合剂对急性坏死性胰炎肠道细菌移位影响的比较研 [J]. 世界华人消化杂志, 1999, 7(6):525528.

　　[3]MA ZH, MA QY, WANG LC, et al. Effect of Resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancretitis [J]. Inflamm Res, 2005, 54(12):16.

　　[4]沙焕臣，马清涌，王连才. 白藜芦醇对大鼠重症急性胰腺炎肠黏膜细胞凋亡的影响 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2006, 27(6):593595.

　　[5]秦勇，马清涌，党晓燕. 白藜芦醇对早期重症急性胰腺炎大鼠多器官组织氧自由基的影响 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2007, 28(5):572574.

　　[6]FRIJUS CJ, KAPPELLE LJ. Inflammatory cell adhesion molecules ischemic cerebrovascular disease [J]. Stroke, 2002, 33(8):21152122.

　　[7]JHA KR, MA QY, SHA HC. The protective effect of resveratrol on the intestinal mucosal barrier in rats with severe acute pancreatitis [J]. Med Sci Monitor, 2008, 14(1):2833.

　　[8]WANG LC, MA QY. Effects of resveratrol on calcium regulation in rats with severe acute pancreatitis [J]. Eur J Pharm, 2008, 500(2):271276.