VEGF和metastin的表达与乳腺癌临床病理的关系

　　作者：徐周，张子恒，黄金宁，张远起 作者单位：1. 广东省电白县人民医院普外科，广东电白525400;2. 广东医学院附属医院乳腺外科，广东湛江 524001

　　【摘要】 目的 分析血管内皮生长因子(VEGF)和KISS1基因编码产物metastin与乳腺癌生物学行为的关系。方法 采用免疫组化SP法观察70例乳腺癌组织和癌周正常组织中VEGF 和metastin的表达情况。结果 VEGF在乳腺癌组织中的阳性表达率为88.6%(62/70)，在癌旁正常组织中的阳性表达率为42.9%(30/70)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01);metastin在乳腺癌组织中的阳性表达率为30.0%(21/70)，在癌旁正常组织中的阳性表达率为72.9%(51/70)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。VEGF表达水平与乳腺癌肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，metastin表达水平与乳腺癌TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 VEGF和metastin在乳腺癌发生、发展过程中发挥了一定的作用，VEGF与metastin表达水平的同时检测，对分析乳腺癌恶性程度和预后有重要意义。

　　【关键词】 血管内皮生长因子; metastin;乳腺癌;免疫组织化学

　　Expression of vascular endothelial growth factor and metastin and its correlation to clinicopathological features in breast carcinoma

　　XU Zhou1, ZHANG Ziheng1, HUANG Jinnin1, ZHANG Yuanqi2 (1. Department of General Surgery, Dianbai People's Hospital, Dianbai 525400,China)

　　Abstract:Objective To analyse the relationship between expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and metastin and biological behaviour in breast carcinoma.Methods Expression of VEGF and metastin in 70 breast carcinomas and parecancerous tissue was observed by SP immunohistochemical method.Results Compared with the parecancerous tissue, expression of VEGF increased, but that of metastin decreased in cancer tissue (P<0.01). VEGF expression was related to tumor size, TNM stage and node metastasis (P<0.05), but metastin expression was only correlated with TNM stage and node metastasis (P<0.05).Conclusion VEGF and metastin may play a role in the development and progression of breast carcinoma, and their detection is useful for evaluating the malignancy and prognosis of this condition.

　　Key words:vascular endothelial growth factor; metastin; breast cancer; immunohistochemistry

　　在我国，乳腺癌的发病率呈逐年上升之势，然而其发生、发展的机制仍不十分清楚，随着肿瘤分子遗传学与分子生物学的发展，目前认为血管生成和肿瘤抑制基因的影响与人类肿瘤的发生、发展和转移过程密切相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用，KISS1是近年发现的肿瘤抑制基因家族中的一个新成员，越来越受到肿瘤界学者的重视。metastin为KISS1基因编码产物，metastin与其受体GPR54作用后从而抑制肿瘤细胞趋化、增殖及转移。为进一步明确VEGF和metastin与乳腺癌生物学行为和预后的关系，我们采用免疫组化SP方法检测70例乳腺癌组织和癌旁正常组织VEGF和metastin的表达情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源

　　收集广东省电白县人民医院2002年1月至2007年12月病理科归档的病历资料完整的70例乳腺癌组织标本，按《中国常见恶性肿瘤诊治规范》进行病理诊断和分级，所有患者术前均未行化疗或放疗。同时另取癌旁非肿瘤的正常组织石蜡标本为对照。

　　1.2 主要试剂

　　鼠抗人VEGF单克隆抗体购自福州迈新试剂公司;兔抗人KISS1蛋白metastin(4554)NH2单克隆抗体购自美国Phoenix制药公司，SP试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 常规病理学检查 所有标本均经体积分数为10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色供病理观察。肿瘤组织学分级参照国际胰腺癌组织学分级标准。

　　1.3.2 免疫组化检测 石蜡包埋组织以4～5μm厚度连续切片，常规脱蜡至水，采用SP法按说明书进行免疫组化染色;用已知切片作阳性替代对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3.3 阳性结果的判定和图像分析 对于VEGF，在光镜下有棕黄色颗粒反应出现在细胞膜、细胞浆中均为阳性反应细胞，高倍镜下阳性细胞数占视野10%以下为阴性(-);高倍镜下阳性细胞数占视野10%以上为有意义，计为阳性。10%～30%为(+)，31%～50%为()，>50%为()，(+)～()均表示为阳性(+)。对于metastin，在光镜下有棕黄色颗粒反应出现在细胞质中为阳性反应细胞，高倍镜下阳性细胞数占视野10%以下为阴性(-);高倍镜下阳性细胞数占视野10%以上为有意义，计为阳性。10%～30%为(+)，31%～50%为()，>50%为()，(+)～()均表示为阳性(+)。

　　1.4 统计学处理

　　采用χ2或校正χ2检验，取α=0.05水准。

　　2 结果

　　2.1 VEGF和metastin在乳腺癌组织与癌旁正常组织中的表达

　　VEGF在乳腺癌组织中的阳性表达率为88.6%，在癌旁正常组织中的阳性表达率为42.9%，两者比较差异有统计学意义(P<0.01);metastin在乳腺癌组织中的阳性表达率为30.0%，在癌旁正常组织中的阳性表达率为72.9%，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。表1 VEGF和metastin在乳腺癌组织与癌旁正常组织中的表达情况

　　2.2 VEGF在乳腺癌组织中的表达与临床病理因素之间关系见表2。结果表明VEGF表达水平与乳腺癌肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。表2 VEGF蛋白表达水平与乳腺癌临床病理因素的关系

　　2.3 metastin在乳腺癌组织中的表达与临床病理因素之间关系

　　见表3。结果表明，metastin表达水平与乳腺癌TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。

　　3 讨论

　　肿瘤的发展经历瘤细胞增殖、浸润和转移3个阶段，正常细胞发育过程中，在各种内外因素的刺激下异质化形成瘤细胞，瘤细胞在分化增殖过程中，当瘤细胞堆积形成的肿块直径达到1～2 mm，必须有血管形成来提供营养，否则肿块不会继续增长，血管形成又为瘤细胞浸润和转移提供了条件。血管形成是一个复杂的表3 metastin蛋白表达水平与乳腺癌临床病理因素的关系过程，首先是血管内皮细胞在血管形成生长因子的作用下被激化活，然后血管外基质降解，内皮细胞以长芽的方式增殖和迁移，形成新生血管，最后新生血管的基底膜形成。

　　VEGF是目前所知的作用最强、特异性最高的促血管生成因子，比组胺作用强5万倍，在肿瘤血管生成过程中发挥核心作用。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移[12]。多数实体瘤均过度表达VEGF,肿瘤血管生成也与胰腺癌的发生、发展和转移相关。

　　von Marschall等[3]运用免疫组化和原位杂交技术,发现胰腺肿瘤管状上皮细胞较之正常胰腺和慢性胰腺炎组织标本，VEGF和VEGFR(血管内皮生长因子受体) 存在过度表达现象;在此项研究中，多组人类胰腺癌细胞系中证实有VEGF 和VEGFR存在，且分泌VEGF旺盛;用VEGF结合VEGFR阳性的细胞，发现胰腺癌细胞生长明显增多。本组通过免疫组织化学法测定结果表明，VEGF在乳腺癌的肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，且在肿瘤组织中VEGF蛋白表达强度与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移有关，提示VEGF可作为反映乳腺癌生物学行为的一个重要指标。Asano等[4]证明在裸鼠中抗VEGF单抗MV833可强烈抑制25种人类肿瘤细胞系移植瘤如大肠癌、肺癌、乳腺癌等的生长，表明抗VEGF单抗治疗肿瘤的可行性和广谱性。

　　本文通过免疫组化SP方法测定结果表明，VEGF在乳腺癌的肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，且在肿瘤组织中VEGF蛋白表达强度与乳腺癌肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移有关，提示VEGF可作为反映乳腺癌生物学行为的一个重要指标。

　　肿瘤转移是恶性肿瘤的基本生物学特点，对肿瘤转移抑制基因的研究已成为肿瘤转移机制研究的热点。KISS1是Lee等[5]1996年首先在黑色素瘤细胞株发现的肿瘤转移转移基因，其表达产物为metastin;KISS1在正常组织中有广泛表达，如脑、睾丸、肝脏、胎盘和小肠等组织中都有不同水平表达，其中胎盘组织中表达水平最高，而在多种存在转移的肿瘤组织中表达缺失。近年来的研究表明，KISS1基因编码的蛋白metastin具有潜在的抗转移作用，metastin与其蛋白受体GPR54结合后引起一系列生理生化改变，从而抑制肿瘤细胞的转移。Ringel等[6]检测KISS1及其受体在10例甲状腺滤泡状癌、13例乳头状癌、2例良性非功能性滤泡状腺瘤、11例甲状腺正常组织中的表达情况，发现大多数正常组织、良性肿瘤、转移能力弱的乳头状癌均有KISS1表达，而10例转移能力强的甲状腺滤泡状癌仅有2例表达，而其余均表达缺失，乳头状甲状腺癌中KISS1受体mRNA水平显著高于正常甲状腺组织(P=0.002)和甲状腺滤泡状癌(P=0.004)，表明KISS1和(或)受体具有调控甲状腺癌生物学行为的作用。Masui 等[7]的研究发现：胰腺癌组织中KISS1的表达明显低于正常组织(P=0.018);姜涛等[8]采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶连接(SP)法检测50例子宫内膜癌，13例子宫内膜上皮性瘤样病变及18例正常子宫内膜组织中KISS1及MMP9的表达情况和其与各种临床病理参数的关系，同时分析两者表达的相关性，结果发现KISS1蛋白metastin在子宫内膜癌组中的表达率(48.0%)明显低于子宫内膜上皮性瘤样病变组(92.3%)及正常内膜组(83.3%)，并且其在子宫内膜癌组中的表达率与临床分期、组织学分级、肌层浸润深度及淋巴结转移密切相关(P均<0.05)，MMP9在子宫内膜癌组(58.0%)和子宫内膜上皮性瘤样病变组(76.9%)中的表达明显高于正常内膜组(27.8%)，其在子宫内膜癌组中的表达率也与临床分期、肌层浸润深度密切相关(P均<0.05)，KISS1蛋白metastin与MMP9在子宫内膜癌中的表达存在明显负相关(P<0.05)，结论提示KISS1蛋白metastin的表达缺失和MMP9的表达可能与子宫内膜癌的浸润、转移有关;多因素分析发现KISS1是最强的独立预后因素。

　　本组通过免疫组化法测定结果表明KISS1基因编码产物metastin在乳腺癌的肿瘤组织中的表达强度明显低于正常组织，且在肿瘤组织中metastin表达强度与乳腺癌TNM分期、淋巴结转移等有密切关系，表明了KISS1基因编码产物metastin可能是影响乳腺癌转移的众多因素之一。上述结果表明VEGF和metastin在乳腺癌发生、发展过程中发挥了一定的作用，可作为预测乳腺癌恶性潜能和预后的新的生物学标记物。

　　【参考文献】

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　　[4] Asano M, Yukita A, Suzuki H. Wide spectrum of antitumor activity of a neutralizing monoclonal antibody to human vascular endothelial growth factor [J]. Jpn J Cancer Res, 1999, 90(1):93100.

　　[5] Lee J H, Miele M E, Hicks D J, et al. KiSS1, a novel human malignant melanoma metastasissuppressor gene [J]. J Natl Cancer Inst，1996，88(23):17311737.

　　[6] Ringel M D, Hardy E, Bernet V J, et al. Metastin receptor is overexpressed in papillary thyroid cancer and activates MAP kinase in thyroid cancer cells [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(5):2399.

　　[7] Masui T, Doi R, Mori T, et al. Metastin and its variant forms suppress migration of pancreatic cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 315(1):8592.

　　[8] 姜涛，林蓓，马颖，等. KiSS1蛋白metastin及基质金属蛋白酶9在子宫内膜癌组织中的表达及意义[J]. 广东医学，2005，26(6):802804.