胃癌细胞凋亡指数与微血管密度及淋巴滤泡均数的关系
发表时间：2010-04-27 浏览次数：617次
作者：巩念明 刘执玉 丁洪基
【关键词】胃肿瘤?细胞凋亡?毛细血管?淋巴滤泡
有人提出，是低度凋亡和高度增殖相结合的病理过程促进了胃癌的发生和发展[1、2]。我们设想，除了癌细胞的增殖，作为其血供直接来源的瘤体内微血管以及邻近免疫组织特别是淋巴滤泡的增殖情况应该与肿瘤的发生具有某种相关性。为此我们观察了胃癌细胞凋亡指数和病变区域微血管密度、淋巴滤泡均数之间的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
胜利油田石油管理局中心医院1993年1月~1994年11月临床及病理资料比较完整的胃癌手术切除标本81例，男69例，女12例，年龄29~83岁。所有病例手术前均未接受化疗、放疗或免疫疗法。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，制成4μm厚连续切片。
1.2 方法
1.2.1 TUNEL染色显示凋亡细胞
细胞凋亡原位检测试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品。染色步骤：①切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化;②3mL/L H2O2封闭30min;③20mg/L蛋白酶K消化20min;④TUNEL反应液，37℃孵育60min;⑤过氧化物酶连接的抗荧光素抗体，37℃孵育30min;②~⑤后均以10mmol/L PBS(pH7.4)振洗3次，每次5min;⑥DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片。以PBS替代TUNEL反应液作阴性对照，阳性对照切片经DnaseⅠ预处理10min，再接TUNEL染色步骤。凋亡细胞核呈蓝黑色，背景细胞核为红色。见图1(略)。
凋亡指数(apoptosis index,AI)：光镜下选凋亡细胞最多的5个高倍视野，每个视野计数100个细胞中凋亡细胞数，取其平均值为AI。(-)：AI5%，(+)：AI 5%~10%，(++)：AI 11%~15%，(+++)：AI15%。
1.2.2 SP免疫组化染色显示微血管
SP染色试剂盒及第1抗体FⅧ为Maxim公司生产(购自福州迈新生物技术开发公司)。用不加一抗的切片作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照，用DAB显色，苏木素复染。见图2(略)。
微血管密度(Microvessel density,MVD)：光镜下，10×20倍视野下选3个被FⅧ相关抗原染成棕色的微血管最密集视野，计数微血管数，计算其平均值为MVD。凡是管腔大于8个红细胞大小、带有肌层的血管均不予计数。
1.2.3 Warthinstarry染色显示淋巴滤泡
①石蜡切片常规脱蜡;②浸入60℃1%AgNO3中30min;③滴显影液1~2min至呈棕黄色;④用56℃蒸馏水快速冲洗，脱去明胶;⑤常温蒸馏水冲洗、脱水、透明化、封固。见图3(略)。
淋巴滤泡均数：在10×4低倍视野下，选淋巴滤泡较多的部位，计数3个低倍视野下的淋巴滤泡数，计算其平均数。
1.2.4 统计学方法
计量资料用x±s表示，组间比较用t检验。
2 结果
胃癌细胞凋亡指数与微血管密度、淋巴滤泡增多数的关系见表1。表1 同胃癌标本细胞凋亡指数、微血管密度、淋巴滤泡均数(略)
由表中可以看出，随着细胞凋亡指数的增高，微血管密度逐渐降低，凋亡指数(-)与凋亡指数(+)及凋亡指数(++)微血管密度之比，存在显著性差异(P0.05);凋亡指数(-)与凋亡指数(+++)微血管密度之比，差异有高度显著性(P0.01)。
同时，随着凋亡指数的增高，淋巴滤泡均数逐渐降低，凋亡指数(-)与凋亡指数(+)及凋亡指数(++)淋巴滤泡之比，差异有显著性(P0.05);凋亡指数(-)与凋亡指数(+++)淋巴滤泡之比，差异有高度显著性(P0.01)。
3 讨论
细胞凋亡是多细胞生物体内的一个重要生命现象，既可出现于个体发育过程中，也可发生于成体的正常生理或病理过程中。细胞凋亡和许多疾病的发生、发展密切相关，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性病变、艾滋病等[3]。
已经有证据表明，胃癌细胞凋亡指数高低和胃癌的恶性程度具有相关性，即凋亡指数越低，其分化程度越低且发生早期转移的可能性越大[4]。
Folkman提出的假说认为，肿瘤的生长大致可分为两个阶段，即肿瘤细胞的克隆性必增殖期(无血管期)和血管形成期。当一个肿瘤生长到几毫米时，其进一步的生长需要新的血管生成，而新生血管形成程度又与肿瘤浸润及转移的发生有关[5]。本研究表明，胃癌细胞凋亡指数与微血管数量呈负相关，即凋亡指数越高，微血管密度越低。可能的解释是，微血管密度的增高，必然增加了肿瘤的血液供应，良好的血液供应有利于肿瘤的生长，减少癌细胞凋亡，这与Folkman的假说相一致。
淋巴滤泡又称淋巴小结，呈圆形或椭圆形，由淋巴细胞密集而成，其中以B淋巴细胞为主，尚有少量T淋巴细胞和巨噬细胞，形态结构随生长发育程度和免疫功能状态而处于动态变化之中。肿瘤作为机体内的一种异物被淋巴细胞识别后，必然伴随免疫反应的发生，其中既有细胞免疫也有体液免疫参与[6、7]。本实验表明，随着凋亡指数的增高，淋巴滤泡均数却逐渐降低。其原因尚难解释，今后我们将通过更多病例的研究和对胃癌患者免疫指标的术前术后动态检测，结合病理学改变作进一步的研究。
参 考 文 献
[1]姚永莉，张万岱.幽门螺杆菌与胃癌的关系[J].世界华人消化杂志，2001，9(9)：10451049.
[2]张申.胃癌肝转移早期诊断及预测的研究进展[J].中国现代普通外科进展，2004，7(16)：327.
[3]刘军喜，刘士廉.激素与细胞凋亡[J].中华内科杂志，1995，34(10)：712715.
[4]丁士刚，林三仁，吴国荣，等.胃癌组织中CD105标记的微血管密度及其临床意义[J].中华消化杂志，2004，24(7)：431432.
[5]Tanaka F,Otake Y,Yanagihara K,et al.Evaluation of angiogensis in nonsmall cell lung cancer:comparison betwenn their CD34 antibody and their CD105 antibody[J].Clin Cancer Res,2001,7:34103415.
[6]胡建斌，邓甬川，郑树.肿瘤组织中免疫球蛋白基因SNC73的表达及其临床意义[J].中华肿瘤杂志，2002，24(1)：3840.
[7]王建璋.肿瘤与免疫[J].中华耳鼻咽喉科杂志，2002，37(2)：149152.
[基金项目]山东省自然科学基金项目(No Y2002C03)
巩念明,等.胃癌细胞凋亡指数与微血管密度及淋巴滤泡均数的关系
1山东大学医学院淋巴学研究室(山东济南 250012)
2胜利石油管理局中心医院病理科(山东东营257034)
