TRAIL受体在胰腺癌中的表达及意义
发表时间：2010-04-23 浏览次数：581次
作者：公伟 梁飞 李占元 曾庆东 刘军 王磊 吕斌 周勇
【摘要】目的：研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体在胰腺癌中的表达及意义。方法：应用半定量RTPCR，检测TRAILR mRNA在胰腺癌组织，正常胰腺组织及胰腺癌细胞系ASPC1、Canpan2中的表达。结果：死亡受体DR4、DR5在所有胰腺癌组织、正常胰腺组织及胰腺癌细胞系中均有表达，诱骗受体DcR1、DcR2在所有正常胰腺组织及细胞系中均有表达。死亡受体DR4、DR5在胰腺癌组织中有较高的表达，而在正常胰腺组织中呈中低水平表达(P<0.01)。胰腺癌细胞系中死亡受体DR4、DR5呈高水平表达，而诱骗受体DcR1、DcR2仅呈中低水平表达。结论：TRAIL受体在胰腺癌普遍表达，并存在受体类型的表达差异;死亡受体在胰腺癌中高表达，可能在TRAIL诱导胰腺癌细胞凋亡的机制中发挥重要的作用。
【关键词】胰腺肿瘤?肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体?肿瘤坏死因子相关凋亡配体受体
Expression and significance of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand recepors in pancreatic carcinoma
GONG Wei,LIANG Fei,LI Zhanyuan,ZENG Qingdong,LIU Jun,WANG Lei,Lü Bin,ZHOU Yong
1Center of organ Transplantation,3Department of General Surgery,Shandong Provincial Hospital(Jinan 250021,China)
2Department of General Surgery,Qilu Hospital of Shandong University(Jinan 250012,China)
【ABSTRACT】Objective:To investigate the expression and significance of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand(TRAIL) recepors in pancreaitc carcinoma.Methods:The expression of TRAILR mRNA was assayed by semiquantitive RTPCR in 30 pancretic carcinoma tissues,18 normal pancreatic tissues and 2 pancreatic cancer cell lines of ASPC1、Canpan2.Results:The expression of death receptor 4(DR4) and death receptor 5(DR5) was detected in all pancreatic carcinoma tissues,normal pancreatic tissues and pancreatic cancer cell lines,decoy receptor (DcR1) and decoy receptor 2(DcR2) were expressed in normal pancreatic tissues and pancreatic cell lines.The expression of DR4 and DR5 in the pancreatic carcinoma tissues was significantly higher than that in the normal pancreatic tissues(P0.01).Conclusion:TRAILR expression is prevalent in pancreatic tissues with different receptor types existing.High death receptor expression may play an important role in TRAIL inducing pancreatic carcinoma apoptosis.
【KEY WORDS】Pancreatise neoplasms?TRAIL?TRAIL receptor 肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)是新近发现的肿瘤坏死因子家族成员，体内外实验表明，TRAIL可选择性的诱导某些肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常细胞无明显的杀伤作用[14]。本研究采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测TRAIL受体在胰腺癌组织、正常胰腺组织及两株胰腺癌细胞系中的表达分布情况，为探讨TRAIL诱导胰腺癌凋亡的作用机制提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料胰腺癌组织30例，为2002~2004年山东大学齐鲁医院普外科及山东省立医院普外科手术标本，18例正常胰腺组织来源于同期切除良性胰腺肿瘤的边缘正常组织，所有标本均在手术切除后迅速冻存于液氮中，然后-80℃低温保存。全部病例术前均未经放化疗，术后经病理检查证实。人胰腺癌细胞株ASPC1来自中国科学院上海细胞研究所，Canpan2细胞株来自北京协和医院病理教研室。细胞在37℃、5%CO2饱和湿度条件下，培养于含10%灭活的小牛血清(杭州四季青公司)、100U/ml青霉素和链霉素的RPMI1640培养液(Gibco公司)中。MMLV逆转录酶为Promega公司产品。Taq DNA聚合酶购自上海博亚生物公司。Alphalmager2200凝胶电泳扫描仪为美国Alpha Innotech公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计和合成根据文献[5、6]，设计了DR4、DR5、DcR1、DcR2及内参照βactin的引物，序列如表1所示，扩增片断分别为525bp、567bp、550bp、464bp、和298bp。上述引物均由上海博亚生物公司合成。表1 5种引物序列(略)
1.2.2.1 RNA的提取肿瘤细胞培养至对数生长期时，消化、离心收集，取约5×106个细胞，加预冷变性液500μl，充分摇动，使细胞裂解完全。取100mg组织置组织匀浆器中，加预冷变性液500μl，在冰浴中充分匀浆，加乙酸纳50μl，颠倒混匀。加水饱和酚500μl，氯仿/异戊醇(49∶1)100μl，剧烈振荡混匀，置冰上10min。4℃离心，14000r/min×10min。小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的离心管中。加入等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。4℃离心，14000r/min×10min，弃上清。加入75%乙醇700μl，洗涤RNA沉淀2次。4℃离心，14000r/min×10min，弃上清，将沉淀晾干。加入适量DEPC水20~30μl溶解RNA。
1.2.2.2 逆转录反应取总RNA5μl，Olig(dT)1μl,dH2O5μl,70℃5min后，冰上放置2min，再加入5×buffer 4μl,dNTP 2μl,Rnase inhibitor 0.5μl,dH2O 1.5μl,37℃5min。加MMLV1μl，42℃1h,70℃10min,4℃取出，-20℃保存。
1.2.2.3 PCR反应20μlPCR反应体系中，分别含有cDNA2μl,上下游引物(12.5μmol/L)0.8μl,10×PCR Buffer2μl,MgCL21.2μl,dNTP0.4μl,Taq酶0.1μl。DR4、DcR1及βactin的反应条件为：94℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火45s,72℃延伸45s,循环30次，末次72℃延长7min。DR5、DcR2的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s,61℃退火45s,72℃延伸45s，循环30次，末次72℃延长7min。
1.2.3 RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析取RTPCR产物10μl，加入1.5%琼脂糖凝胶中(含少量溴化乙锭)，75V电泳40min;电泳结果用凝胶成像分析系统照相并测出TRAIL受体与βactin的吸光度值，以TRAIL受体与βactin吸光度值的比值，表示TRAIL受体的相对表达强度。
1.3 统计学分析、采用SPSS10.0对相关数据进行分析，以P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
死亡受体DR4、DR5在所有胰腺癌组织、正常胰腺组织及胰腺癌细胞系中均有表达，诱骗受体DcR1、DcR2在所有正常胰腺组织及胰腺癌细胞系中均有表达，而在胰腺癌组织仅有18例表达诱骗受体DcR1,20例表达诱骗受体DcR2。TRAIL受体DR4、DR5、DcR1、DcR2及内参照βactin的 RTPCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果见图1(略)。半定量分析表明，死亡受体DR4、DR5在胰腺癌组织中有较高的表达，而在正常胰腺组织中呈中低水平表达。胰腺癌组织中的DR表达量显著强于正常胰腺组织(P0.01)。胰腺癌细胞系中死亡受体DR4、DR5呈高水平表达，而诱骗受体DcR1、DcR2仅呈中低水平表达。见表2。表2 胰腺癌、正常胰腺与胰腺癌细胞株TRAIL受体表达水平的比较(略)
3 讨论
TRAIL又称Apo2L，是由Wiley[1]于1995年发现并克隆成功的，它是继TNF和Fasl之后发现的第3个TNF超家族中的凋亡分子。TRAIL表达于人体多种正常组织，可以诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡，而对正常细胞无明显的杀伤作用。TRAIL通过与靶细胞膜相应的受体结合而发挥生理作用，目前发现TRAIL有5个受体[7~9]：死亡受体DR4、DR5，诱骗受体DcR1、DcR2及可溶性受体OPG。DR4和DR5具有与TNF受体超家族其它成员类似的胞浆死亡区，与TRAIL特异性结合后可通过死亡结构域激发和传导凋亡信号，激活Caspase蛋白酶解级联反应，导致细胞死亡。DcR1和DcR2的胞外区均有2个与DR4、DR5高度同源的富含半胱氨酸的重复序列，但是DcR1无胞内区，DcR2的胞内死亡区不完整，呈无功能的截断状态。因此DcR1和DcR2与TRAIL结合后都不能传导凋亡信号，其可溶性形式能与DR4和DR5竞争与TRAIL的结合，抑制配体介导的细胞凋亡。OPG在体内有抑制破骨和增加骨密度的功能，并与TRAIL有交叉性调节作用，但是不能诱导细胞凋亡。TRAIL受体的发现揭示了一种新的细胞凋亡调控机制，即通过假受体竞争性抑制配体，从而诱导细胞凋亡。
TRAIL分子与其膜表面受体结合，是TRAIL发挥其诱导凋亡功能的关键一步。研究TRAIL受体在胰腺癌中的表达，对进一步研究TRAIL诱导胰腺癌细胞凋亡的机制具有重要的意义。研究发现，死亡受体DR4和DR5在许多肿瘤细胞和正常细胞都有不同程度的表达，而诱骗受体DcR1和DcR2多在正常细胞中高表达，肿瘤细胞常缺乏表达。我们的研究发现，胰腺癌组织普遍存在TRAIL受体的表达，并存在受体类型的表达差异，肿瘤组织中的DR表达量显著强于正常胰腺组织(P0.01)。胰腺癌组织中死亡受体DR4、DR5高表达，可能在TRAIL诱导胰腺癌细胞凋亡的机制中发挥重要的作用。但TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的敏感性是否与死亡受体的表达水平相一致，尚待进一步研究证实。另外，诱骗受体DcR1、DcR2在胰腺癌组织、正常胰腺组织及胰腺癌细胞系中均有不同程度的表达，说明TRAIL受体分布的差异性，并非TRAIL通路选择性杀伤作用的唯一因素，除受体调控模式外，还应当有其它的因素参与。
目前发现许多抗肿瘤治疗与诱导肿瘤细胞凋亡有关，但诸多诱导凋亡物质可引起非选择性杀伤作用或其他副作用而难以进入临床作用，如TNF启动严重的炎症反应，Fas引起严重的肝损伤。研究表明，TRAIL在体内外均具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，而未发现明显的副作用，且其作用为P53依赖性，因此TRAIL在肿瘤的治疗中具有良好的应用前景，可能为胰腺癌提供一种新的治疗途径。
参 考 文 献
[1]Wiley SR,Schooley K,Smolak PJ,et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis[J].Immunity,1995,3(6):673682.
[2]Ashkenazi A,Pai RC,Fong S,et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].J Clin Invest,1999,104:155162.
[3]王亚军.TRAIL在胰腺癌研究中的进展[J].中国现代普通外科进展，2004，2(4)：198.
[4]张秋.TRAIL与消化系统肿瘤[J].中国现代普通外科进展，2003，6(3)：141.
[5]Weihong L,Ethan B,Jessica YC,et al.Tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand and chemotherapy cooperate to induce apoptosis in mesothelioma cell lines[J].Am J Respire Cell Mol Biol,2001,25:111118.
[6]Kennichi S,Kenzo K,Morihisa H,et al.Tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand and its receptor expression and the pathway of apoptosis in human pancreatic cancer.[J].Pancreas,2001,23(3):251258.
[7]Pan G,O’ rourke K,chinnaiyan AM,et al.The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL[J].Science,1997,276:111113.
[8]Pan G,Ni J,Wei YF,et al.An antagonist decoy receptor and a death domaincontaining receptor for TRAIL[J].Science,1997,277:815818.
[9]Emery JG,McDonnell P,Burke MB,et al.Osteoprotegerin is a receptor for the cytotoxic ligand TRAIL[J].J Biol Chem,1998,273:1436314367.
公伟，等.TRAIL受体在胰腺癌中的表达及意义
1山东省立医院器官移植中心普外科(山东济南250021)
2山东大学齐鲁医院普外科(山东济南250012)
