实验性癫疒间大鼠发作后海马γ氨基丁酸B受体亚单位的表达及其激动剂的影响
发表时间：2010-02-10 浏览次数：685次
实验性癫疒间大鼠发作后海马γ氨基丁酸B受体亚单位的表达及其激动剂的影响作者：汤继宏 作者单位：215003苏州大学附属儿童医院 【摘要】 目的 观察海人酸(KA)诱导的实验性癫疒间(EP)大鼠发作后海马γ氨基丁酸B受体(GABABR)亚单位mRNA表达及其激动剂巴氯芬的影响。方法 运用原位杂交法检测各实验组大鼠EP发作后及巴氯芬干预后海马区GABABR亚单位GAR1a及GAR2 mRNA表达。结果 KA致疒间早期(6～12 h)2种亚单位mRNA表达水平广泛下降，至1 d仍明显低于对照组(均P<0.05)，但齿状回（DG）区mRNA表达开始回升，3 d后表达水平已明显高于对照组(P<0.05)，而CA1与CA3区表达仍维持低水平(均P<0.05)，但其表达水平渐向对照组水平恢复。巴氯芬干预后亚单位表达明显下降的时间点延迟，且表达水平明显高于非干预的致疒间组（P<0.05～0.01）。结论 致疒间鼠2种亚单位表达下降后又上调为颞叶EP的内源性自我保护机制；巴氯芬促进2种亚单位表达，增强GABA抑制作用，有利于控制EP，为筛选针对GABABR亚单位的抗疒间药提供新途径。 【关键词】 颞叶癫疒间 γ氨基丁酸B受体 海马 海人酸 Expression of GABAB recepter subunit in hippocampus and effect of its agonist after experimental epileptic rats TANG Jihong, BAO Shiyao, ZHANG Zhilin. Childrens Hospital Affiliated to Soochow University, Suzhou 215003, China Abstract: Objective To explore the expression of Gammaaminobutyric acid B recepter (GABABR) subunits mRNA and the effects of its agonist Baclofen in hippocampus after KA induced seizures,of experimental epileptic rats.Methods The GABABR subunits GAR1a及GAR2 mRNAs expression were determined in hippocampus of each experimental group after epileptic seizure and Baclofen interference by hybridization in situ. Results In early(6～12 h) time of KA induced epileptic rats, the mRNA levels of both receptor subunits in hippocampal formation were found downregulation widespreadly (all P<0.05).One day after onset the decrease of mRNA levels persisted in sectors CA1 and CA3,however, mRNA levels in the dentate gyrus increased rapidly and then higher than the levels of control group(P<0.05),and mRNA levels in sector CA3 partially recovered to control levels at late time points.The time point of decreases of subunit mRNA expression in baclofen interference group was later than that of KA induced seizure group.The mRNA expression levels in baclofen intereference group were singnificantly higher than that of KA induced seizure group(P<0.05～0.01). Conclusions This is the result of endogenous antiepileptic mechanism of TLE for the early downregulation of GABABR mRNAs and then upregulation of GABABR subunits mRNAs.Baclofen can elevate expression levels of both subunits,and enhance GABA mediated inhibition which may promote binding of GABA to the GABA receptor, and benefit for controlling the development of EP.The findings of subunit changes may provid the way for screening the new antiepileptic drug of a single receptor subunit. Key words：temporal lobe epilepsy；GABAB receptor；hippocampus；kainic acid 颞叶癫疒间(EP)是最常见的难治性局灶性EP，颞叶内侧的海马结构［CA1、CA2、CA3、CA4区和齿状回(DG)］在颞叶EP发生发展过程中起重要作用，尤其是其突触兴奋性和抑制性的平衡关系，轻度抑制下降即可产生EP发作［1］。为此，本研究应用原位杂交法，探讨海人酸(KA)诱导颞叶EP发作后2种γ氨基丁酸B受体(GABABR)亚单位(GBR1a和GBR2)的表达变化及其激动剂的影响，以进一步了解颞叶EP上GABABR亚单位的作用和可能的适应性变化。1 材料与方法 1.1 动物与分组 选用苏州大学实验动物中心提供的48只健康雄性SD大鼠（质量200～250 g）,随机分成致疒间组（32只）和药物干预组（16只）。致疒间组再分为对照组和致疒间后6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、15 d和30 d组（每亚组4只）。药物干预组再分为对照组和致疒间后6 h、1 d和3 d干预组（每亚组4只）。 1.2 方法 1.2.1 动物模型制作 KA诱导颞叶EP模型和对照模型的制作按本实验室所建立的方法［2］进行。致疒间后大鼠发作程度按Racine分级标准［2］，达到Ⅳ级以上且存活作为实验大鼠，未达到Ⅳ级者弃用而重新选鼠致疒间。 1.2.2 药物预处理方式 用生理盐水将巴氯芬稀释成0.25%的溶液，按10 mg/(kg·d)剂量给大鼠灌胃，实施保护性预处理，连续6 d，达到稳态浓度后，开始致疒间。致疒间后6 h、1 d和3 d心脏灌注固定及取脑作为干预组；用2 ml的生理盐水代替巴氯芬灌胃，作为干预对照组。 1.2.3 脑组织标本处理 模型制作成功后在相应时间点麻醉后用生理盐水及4%多聚甲醛心脏灌注，随后取脑组织块放入4%多聚甲醛固定，在4 h内乙醇脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋。 1.2.4 原位杂交检测 采用武汉博士德生物工程有限公司提供的针对GABABR 2种亚单位（GBR1a和GBR2）地高辛标记的寡核苷酸探针原位杂交检测试剂盒，按说明书进行操作。原位杂交完成后，采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分别测定GABABR 2种亚单位在海马CA1、CA3和DG阳性反应细胞的平均光密度值(AOD)。每只鼠取2张海马相同位置的切片，每张切片的每个部位（CA1、CA3、DG）随机取3个视野测量，取其平均值CA1区每个亚组的AOD为该亚组共4只鼠8张切片的平均数。所有切片分析均在同一光学条件及400倍光镜下完成。 1.2.5 统计学方法 用SAS 6.12 version 软件,数据以均数±标准差(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析，再用Dunnett t检验与同一对照组比较。2 结 果 2.1 各组GBR1a和GBR2 mRNA表达的比较 见表1。致疒间6 h与12 h即可见GBR1a和GBR2 mRNA表达水平广泛下降，以CA3、DG区下降明显；致疒间1 d GBR1a和GBR2 mRNA表达水平仍明显低于对照组，以CA3区明显，但DG区mRNA表达开始回升，逐渐达到致疒间对照组水平；致疒间3d DG区GBR1a和GBR2 mRNA表达水平已明显高出对照组，此后保持高表达状态。致疒间3d后，CA1与CA3区表达维持低水平，以后其表达水平渐向对照组水平恢复，尤其是CA3区恢复更为明显。 2.2 巴氯芬激动剂干预后各组GBR1a和GBR2 mRNA表达比较 见表2。致疒间对照组与干预对照表1 各组大鼠海马GBR1a和GBR2 mRNA AOD值的比较表2 致疒间组与干预组大鼠海马GBR1a和GBR2 mRNA AOD值的比较注：与干预对照组比较*P<0.05, △P<0.01;与同时点致疒间组比较▲P<0.05, ◆P<0.01 组GBR1a和GBR2 mRNA表达差异无统计学意义（均P>0.05）；致疒间6 h，干预组表达水平无明显下降；致疒间1d，海马各亚区的GBR1a mRNA表达水平继续下降，此时干预组的表达水平也明显下降，但比致疒间组下降延迟6 h。在CA1和CA3区，2种亚单位在致疒间6 h、1 d和3 d表达均减少，尤其CA1区持续表达下降，CA3区则于致疒间3 d出现回升趋势；GBR1a和GBR2 mRNA表达水平降低最明显的时间点为CA1区3 d，CA3区1 d，在相应时间点干预组的表达水平显著增高（P<0.05～0.01）。在CA1区3 d，干预组GBR1a和GBR2分别较致疒间组上升42.33%和26.9%；在CA3区1 d，干预组GBR1a和GBR2分别较致疒间组上升48.79%和22.56%。3 讨 论 近年来随着分子生物学实验技术发展，GABABR异常导致EP发生发展机制的研究主要集中在GABAR亚型亚单位基因上。本实验中KA注射诱导EP发作的早期（6～12 h），大鼠海马GABABR GBR1a和GBR2 mRNA表达水平广泛且明显下降，促进了EP的产生和扩展。随后的GBR1a和GBR2 mRNA表达下降可能是由于海马各亚区神经元缺失、具有抑制功能的细胞数目下降所致［3-5］，但致疒间7 d、15 d和30 d，GBR1a和GBR2 mRNA表达呈现逐渐增加趋势，尤其是30 d更为明显，表明残存神经元GABABR亚单位表达上调，以弥补这些区域严重的神经元损害所致的GABA介导功能的缺失。DG区在致疒间6～12 h暂时性下降后很快返回到对照组水平，说明DG区对KA诱导的脑损害具有一定耐受性［3］，颗粒细胞层神经元变性程度较轻，通过较多的残存神经元的表达上调来使其抑制功能代偿性增加，这种亚单位表达的增加可能与EP的控制及终止有关［3］，此亦为机体内源性抗EP机制的作用。近年一些临床研究［4，6］发现，在颞叶EP患者海马CA1和CA3区观察到GABABR表达明显下降，但海马区严重的细胞缺失纠正后，GABABR表达再次增加，表明纠正海马缺失细胞后，海马锥体细胞和颗粒细胞层GABABR mRNA表达水平是增加的，也说明了EP发作后GABABR的适应性保护机制。 EP发作的最后通路是兴奋性和抑制性不平衡导致大脑神经元异常放电，作为中枢神经系统最主要的抑制性神经递质GABA在控制EP发作中具有重要作用。巴氯芬是GABABR激动剂，可刺激GABABR而抑制兴奋性氨基酸释放，抑制EP灶的异常放电，其灌胃经胃肠道迅速完全吸收，并能通过血脑屏障，作用于CNS的GABABR，故常被用于神经递质受体与EP关系的研究［7-9］。用巴氯芬给大鼠保护性预处理后，可见致疒间6 h时，干预组的2种亚单位表达未明显低于相应的对照组，直到致疒间1 d，较致疒间组下降延迟，表明巴氯芬使2种亚单位表达上调，增加了其与GABA结合的受体数量，有利于EP控制和终止。尤其有意义的是，在CA1和CA3区于2种亚单位表达水平降低最明显的时间点为CA1区3 d 和CA3区1 d，干预组亚单位表达水平显著高于致疒间组，显示了巴氯芬较明显的表达增强作用，也提示了在神经元变性及缺失明显的区域，GABABR亚单位表达下降越明显，巴氯芬的预处理作用反而更强。巴氯芬可特异性抑制EP病灶异常放电，但在同浓度下对正常突触电位几乎无影响［8］，提示神经元受损后巴氯芬更易使GABABR亚单位mRNA表达水平增加。 本实验的颞叶EP模型海马锥体细胞缺失，DG区颗粒细胞苔状纤维芽生，使海马神经网络重新整合，形成了兴奋性局部神经回路，从而使兴奋性神经元增多，造成EP的反复发作和长期维持［10］，但是，兴奋性谷氨酸能神经元突触前膜上存在属于异源受体的GABABR［3，4］，巴氯芬可作用于该受体及其亚单位，使其表达功能上调，抑制谷氨酸释放而控制发作。海马结构GABABR亚单位与颞叶EP关系密切，可在抗EP过程中发挥重要作用，虽然其具体的细胞分子机制尚有待进一步研究，但为治疗EP和研究新型抗癫疒间药提供了有益的途径和思路［11］。【参考文献】［1］Telfeian AE，Tseng HC，Baybis M，et al. 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