胃癌组织中livin与caspase9、p53的表达及相互关系

　　作者：赵文江 赵丽华 张锐锋 秦洪 李建英 安亚伟 郝建军 卞永生 作者单位：保定市第一医院普外科，河北 保定 071000

　　【摘要】目的 研究凋亡蛋白livin和 caspase9、p53在胃癌组织中的表达及与胃癌生物学行为关系。方法 采用免疫组化SP检测58例胃癌组织及正常胃黏膜中livin和caspase9、p53的蛋白表达。结果 胃癌组织中 livin和caspase9的、p53蛋白表达阳性率分别为65.5%、20.7%、58.6%，与正常胃黏膜蛋白表达阳性率(分别为3.5%、62.1%、5.2%)比较差异有统计学意义(P<0.05);livin在组织分化差、淋巴结转移者、临床分期高表达率均增高差异有显著性(P<0.05);livin表达与caspase9蛋白表达呈负相关性(rs=-0.195，P<0.05)。livin与p53蛋白表达呈正相关性(rs= 0.851，P<0.05)。结论 livin和caspase9参与胃癌的发生、发展，可能成为胃癌治疗的新分子靶点。抑癌基因p53的失活与凋亡抑制基因livin在胃癌的发生方面可能有相互促进作用。

　　【关键词】 胃肿瘤/病理学 livin caspase 9 p53 免疫组化

　　Study on the expression and relationship of livin and caspase9, p53 in gastric carcinoma

　　ZHAO WenJiang, ZHAO LiHua, ZHANG RuiFeng, et al.

　　Department of General Surgery, Baoding First Hospital, Baoding 071000, Hebei, China

　　【Abstract】 Objective To study the expression of livin and its relationship with expression of caspase9 and p53 in gastric carcinoma tissues. Methods Immunohistochemical SPmethod was used to detect the expression of livin and caspase9, p53 proteins in gastric carcinoma tissues and normal gastric mucosas tissues.Results In gastric carcinoma tissues, the positive expressive rate of livin (65.5% vs 3.5%), caspase9 (20.7% vs 62.1%) and p53 (58.6% vs 5.2%) was respectively significantly higher or lower than that in normal gastric mucosas (all P<0.05). The expression of livin was inversely correlated with the histologic differentiation of the tumor, lymph node metastasis and clinical stage (P<0.05). A significant negative correlations were observed between the expression of livin and caspase9 protein in gastric carcinoma tissues (rs=-0.195, P<0.05)，livin protein expression was positively related to p53 protein expression in gastric carcinoma tissues(rs=0.851，P<0. 05).Conclusions Aberrant expression of livin and caspase9 may be a new target for diagnosis, porgnosis assessment and gene treatment of gastric carcinoma. The aberrant expression of livin and inhibiting carcinoma gene p53 may play facilitative roles in process of carcinogenesis of gastric carcinoma.

　　【Key words】 Gastric neoplasms/pathology; Livin; Caspase9; p53; Immunohistochemistry

　　胃癌的发生是一个多因素、多步骤、多阶段和多基因共同作用的结果，在胃癌发生、发展过程中癌基因和抑癌基因的改变逐渐受到人们的重视，它们在细胞信号传导途径的多个层次起作用。细胞凋亡过程调控异常在肿瘤形成过程中也起十分重要的作用，这种调控机制涉及到促进或阻止细胞凋亡的多种凋亡相关蛋白的参与，整个过程表现为进化上较为保守的级联反应。Bcl2、Fas、Bax等凋亡相关蛋白均作用于级联反应的上游，而直接作用于级联反应的蛋白质分子报道极少。livin是近年来发现的人类凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein family,IAP)家族的新成员，特异的高表达于某些实体肿瘤组织和肿瘤细胞系，能抑制许多凋亡刺激剂诱发的细胞凋亡〔1〕。livin主要功能可能是抑制 caspase家族发挥抗凋亡作用，而caspase9是凋亡的重要执行者。人p53基因定位于17p1311,分为野生型和突变型，野生型p53有促进细胞凋亡的作用。本文着重探讨凋亡蛋白livin和 caspase9、p53在胃癌组织中的表达及与胃癌生物学行为关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 胃癌组织标本58例，为手术切除的胃癌石蜡包埋组织。男34例，女24例，年龄29～76岁，中位年龄61岁。正常胃黏膜组织58例，取自胃癌行胃切除的近侧断端胃黏膜，所有断端均距癌组织5 cm以上，组织学检查为正常胃黏膜。

　　1.2 试剂 鼠抗人livin多克隆抗体和caspase9单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，工作浓度分别为1:100和1:50;兔抗人p53 多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品;SP试剂盒和DAB显色剂购自北京中山技术有限公司。染色步骤按说明书进行。

　　1.3 方法 所有手术切除标本均经4%中性甲醛固定,常规石蜡包埋后行4 μm连续切片,每例均行HE染色和免疫组织化学染色，光镜观察。caspase9用正常胃黏膜，livin、p53用阳性胃癌切片作阳性对照;用0.01 mol/L PBS(pH7.4)液代替一抗作阴性对照。

　　1.4 结果判定 livin和caspase9、p53蛋白染色阳性均为在胞质内或胞核出现棕黄色颗粒，且其着色强度高于背景非特异性染色者。每例切片随机选取5个高倍视野进行结果判定。按染色强度及阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分比综合计分。染色强度：无色计为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞数：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。染色强度得分与阳性细胞数得分相乘，0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性()，≥6分为强阳性()。

　　1.5 统计学处理 应用SPSS12.0软件包进行统计分析，各个相关因素的差异性比较采用卡方检验，指标阳性表达之间的关系采用Spearman等级相关性分析。

　　2 结果

　　2.1 livin和caspase9、p53蛋白在正常胃黏膜及胃癌病变中的表达 见表1。livin在正常胃黏膜中的阳性表达率(+～)为3.5%，位于胞浆或胞核，livin在胃癌组织中的阳性表达率为65.5%，明显高于在正常胃黏膜中的表达(P<0.05)。caspase9在正常胃黏膜中的阳性表达率(+～)为62.1%，位于胞浆中，caspase9在胃癌组织中的阳性表达率为20.7%(阴性率为79.3%)，明显低于在正常胃黏膜中的表达 (P<0.05)。p53在正常胃黏膜中的阳性表达率(+～)为5.2%，位于胞浆或胞核。在p53胃癌组织中的阳性表达率为58.6%(阴性率为41.4%)，明显高于在正常胃黏膜中的表达(P<0.05)。

　　2.2 livin和caspase9、p53蛋白在胃癌组织中的表达与临床病理因素的关系 见表1。胃癌患者livin和caspase9、p53蛋白表达，在性别、年龄、肿瘤大小、Borrmann分型、分化程度、浸润深度间表达率差异无显著性;在组织学分型、淋巴结转移、临床分期组间表达率增高差异有显著性(P<0.05)。

　　2.3 livin和caspase、p53在胃癌组织中表达的关系 见表1、表2。livin在胃癌组织中的阳性蛋白表达率为65.5%，caspase9在胃癌组织中的阳性蛋白表达率为20.7%，阴性蛋白表达率为79.3%。p53在胃癌组织中的阳性蛋白表达率为58.6%，阴性蛋白表达率为41.4%，livin蛋白表达与caspase9蛋白表达呈负相关性(rs=-0.195，P<0.05)，livin蛋白表达与p53蛋白表达呈正相关性(rs=0.258，P<0.05)。

　　表1 livin和caspase、 p53胃组织中的表达与临床病理的关系(略)

　　表2 livin和caspase、p53在胃癌组织中表达的关系(略)

　　与caspase9比较：rs= -0.195，P<0.05;与p53比较:rs= 0.851，P<0.05

　　3 讨论

　　livin是近年来发现的一个IAP，Lin等〔2〕根据IAP同源序列，用含有BIR序列的EST克隆，在人的胎肾cDNA库中发现了该基因家族的新成员，将其命名为KIAP(kidney inhibitor of apoptosis protein);Kasof等〔3〕根据同源检索发现该基因并将之命名为livin。livin的抗凋亡活性主要依赖于其杆状病毒IAP重复区(Baculoviral IAP Repeat，BIR)的结构域。livin的BIR结构与其他IAP成员非常相似，包含4个α螺旋，1个三股的反向平行的片层结构和一些相应的氨基酸残基，这三者任一结构上的突变均可导致livin生物学作用的变化，主要是影响其抗凋亡的活性。livin选择性表达于多种常见的恶性肿瘤，如膀胱癌〔4〕、人乳腺癌细胞株〔5〕，而在正常组织极少表达。近年来对livin的研究不断增多，认为livin可能作为诱导肿瘤凋亡治疗的一个新靶点而受到关注。

　　caspase是一群促细胞凋亡的含有半胱氨酸的蛋白酶，其酶解底物包括caspase自身及其他因子。Boaz等〔6〕证实，livin与细胞内的几种caspase分子的相互关系，在凋亡促进剂作用下，caspase3、7在特殊的位点(即位于氨基端的DHVD5G和位于羧基端的GARD38V附近的门冬氨酸)裂解livinα、β，它们的裂解位点有高度的一致性，裂解成分包含BIR结构大的羧基端亚结构和包含RING结构小的氨基端亚结构等，含BIR的亚结构不但失去了原来的抗凋亡作用，而且具有促凋亡的作用。

　　p53基因是较早被认识的凋亡调控基因，野生型p53蛋白对细胞周期有重要的调控作用。各种原因导致DNA损伤均可激活野生型 p53蛋白的过度表达,野生型p53的半衰期很短，约为20～30 min，很难检测到，而其突变体在核内聚集,半衰期延长,故可用免疫组化方法检测到〔7〕。p53基因异常与胃黏膜细胞的癌变过程密切相关，突变型p53基因蛋白表答与胃癌的生物学行为，如分化转移移浸润密切相关，野生型p53 基因的状态是肿瘤放疗、化疗是否敏感的重要指标。野生型p53基因半减期短，且不稳定，胃癌组织免疫组化不易检测到，其表达阴性或弱阳性，而突变型p53基因蛋白侧稳定性增加，胃癌组织免疫组化易检测到，其表达阳性率增加〔8〕。本研究结果示胃癌组p53基因蛋白阳性率表达明显高于癌旁组织，说明p53基因蛋白异常表达与胃癌发生、发展在基因水平上有密切相关性。

　　本研究表明，胃癌组织中livin 的表达与性别、年龄、肿瘤大小、Borrmann分型、肿瘤浸润深度无关，与组织分化、淋巴结转移及临床分期有关，组织分化差，淋巴结转移者，临床分期高者livin表达率高，可作为评估胃癌生物学行为和判断预后的生物学指标。caspase9的表达与性别、年龄、肿瘤大小、Borrmann分型、组织分化、肿瘤浸润深度无关，与淋巴结转移及临床分期有关，淋巴结转移者和临床分期高者caspase9表达率高，Livin基因与caspase9阴性表达、与P53表达阳性表达，与Yagihashi等〔9〕研究结果相符。胃癌组织无论livin基因蛋白是否表达，其caspase9基因蛋白水平均较正常胃组织显著下降;二者表达呈负相关。与P53基因蛋白表达正负相关，说明胃癌发生过程中caspase9基因蛋白表达受到抑制。Kasof等〔3〕证明livin能够直接抑制caspase3、7、9的酶水解作用，livin的BIR结构能够与caspase结合而抑制后者的功能。livin还能够在凋亡起始点直接干扰Procaspase9或直接干扰caspase9的活性〔10〕，也说明胃癌发生过程中,p53基因蛋白的失活，促使胃癌基因蛋白的不稳定性，突变型p53起主导作用，使胃癌在基因水平发生点突变、缺失突变、移码突变，基因重排现象，促使胃癌细胞的恶性转化，提示抑癌基因p53的失活与凋亡抑制基因Livin在胃癌的发生方面可能有相互促进作用。胃癌发生、发展不仅与livin凋亡蛋白抑制作用有关，而与caspase9、p53基因蛋白，在基因水平上正负信号转导、调控有密切相关性。livin凋亡蛋白抑制作用及调控caspase9、p53基因的具体作用机制，有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern〔J〕.FEBS Lett，2001;495 (12)：5660.

　　2 Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a navel member of the inhibitor of apoptosis protein family〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;279(3)：82031.

　　3 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member〔J〕.Biol Chem，2001;276(5)：323846.

　　4 杨雯静，杨林西.Livin反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株MCF7增殖和凋亡影响的研究〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2007;14(17)：13025.

　　5 鹿占鹏，王卫国.Livinα在膀胱移行细胞癌组织中表达的研究〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2007;14(14)：109193.

　　6 Nachmias B，Ashhab Y，Bucholtz V,et al.Caspasemediated cleavage converts livin from an antiapoptotic to a proapoptotic factor：implications for drugresistant melanoma〔J〕.Cancer Res，2003;63(19)：63409.

　　7 Hall PA，Lane DP.p53 in tumor pathology：can we trust immunohistochemistry?Revisited〔J〕. Pathology，1994;172(1)：14.

　　8 Blok P，Craanen ME，Dekker W,et al.No evidence for functional inactivation of wildtype p53 protein by MDM2 overexpression in gastric carcinogesis〔J〕.Pathology，1998;186(1)：3640.

　　9 Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of antilivin antibody in gastrointestinal cancer patients〔J〕.Clin Chem，2003;49(7)：12068.

　　10 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.MLIAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas〔J〕.Curr Biol，2000;10(21)：135966.