碱性成纤维细胞生长因子促进兔缺血后肢 血管新生的实验研究

　　作者：马秀现 王志伟 李 枫

　　【摘要】目的：了解局部应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对促进兔缺血后肢血管新生的作用。方法：25只日本大耳白兔随机分2组，外科结扎切断各兔股动脉及其分支，制作兔后肢缺血模型。试验组各兔在缺血后肢肌肉内多次注射重组人bFGF蛋白(n=15);对照组给予等剂量生理盐水(n=10)。术后4周，各兔行腹主动脉造影观察侧支血管形成情况，取内收肌和腓肠肌肌肉行病理切片HE染色应用图像分析系统统计血管密度，并用免疫组织化学方法检测内收肌和腓肠肌中VEGF阳性表达的血管数。结果：试验组兔侧支循环血管条数、血管密度及VEGF阳性表达的血管数均大于对照组(P<0.01)，缺血状态得到改善。结论：在兔缺血后肢肌肉中注射bFGF蛋白可促进血管新生，增加兔缺血后肢血液灌注，改善肢体缺血状态。

　　【关键词】缺血?成纤维细胞生长因子?新生血管化，生理性?兔

　　Basic fibroblast growth factor(bFGF) improves the angiogenesis of the ischemic limbs in rabbits

　　MA Xiuxian1,WANG Zhiwei2,LI Feng2

　　1Depatment of General Surgery,2Department of Gynecology and Obstertrics,the First

　　Affiliated Hospital ,Zhengzhou University(Henan 450052,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To evaluate the effect of local application bFGF on angiogenesis in ischemic limbs of rabbits.Methods:After ischemia models were induced by surgical ligation and cutting off left femoral artery in each rabbit,rabbits were randomized to received intramuscular injection of recombinant human bFGF(n=15)or normal saline(n=10)in ischemic zone.Four weeks later, angiogenesis of ischemia models were observed and evaluated by abdominal aortography,histopathologic analysis and immunohistochemical studies with the antibodies of VEGF.Results:The number of capillaries,the compensatory circulation blood vessel and the vascular endothelial cells that expressed VEGF protein in bFGF group is more than those of saline group(P<0.01).Conclusion:Intramuscular injection of recombinant human bFGF can improve the angiogenesis of the ischemic limbs is rabbits.

　　【KEY WORDS】Ischemia?Fibroblast growth factor?neovascularization physiologic?Rabbtis

　　研究表明，缺血心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ,bFGF)可改善心肌功能，减少梗死面积，增加缺血区小动脉毛细血管数量等作用[1，2]。本实验通过兔缺血后肢肌肉内注射bFGF蛋白 ，观察兔缺血组织血管新生情况及缺血组织血液灌注改善情况。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 成年健康日本大耳白兔25只(由河南省动物实验中心提供)，体重2.5～3.0kg，平均2.8kg，雌雄不限。完全随机分组：对照组(缺血后肢肌注生理盐水)(n=10)，实验组(缺血后肢肌注bFGF)(n=15)。重组人bFGF蛋白(rhbFGF)(购自北京双鹭药业有限公司)，76%复广泛影葡胺(购自上海旭东海普药业有限公司)，兔抗兔VEGF多克隆抗体(购自武汉博士德生物技术有限公司)，SP9000二步法免疫组织化学检测剂盒、DAB显色试剂盒(购自北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2 兔下肢缺血模型 各兔肌注氯胺酮(50mg/kg)获得麻醉效果后，无菌条件下经左侧腹股沟韧带中点(摸到股动脉搏动后)做一纵形皮肤切口2cm，暴露股动脉后， 自股动脉起始部分分离股动脉，在股动脉起始处，用1号丝线结扎并切断，制成兔后肢缺血模型。

　　1.3 实验方法 兔后肢缺血模型备制成功3h后，试验组各兔给予bFGF2000U(约5μg，用生理盐水溶解成2ml),分5点在股动脉结扎处下方肌肉内注射。按此法第3、5、7天各给药1次，共给药4次;对照组按此法给予等剂量生理盐水。

　　1.4腹主动脉造影 术后4周，各兔肌注氯胺铜(50mg/kg)麻醉成功后，开腹，找到腹主动脉 (肾动脉以下段)，分离2cm。用5号头皮针刺入，加压快速推入76%复方泛影葡胺10ml。在推入造影剂过程中观察兔左后肢侧支循环显影情况并摄 X线片。观察侧支循环和新生血管的形成情况。见图1。

　　1.5 组织切片和测量微血管密度 腹主动脉造影后立即处死各兔，取左后肢内收肌和腓肠肌中段肌肉各1cm×1cm×0.3cm大小，甲醛固定，石蜡包埋，按肌肉横断面切片，片厚5μm，连续5张，取第4张行HE染色(在郑州大学医学院病理教研室进行)。使用Biosens Digital Imaging System(V1.6)图像分析系统(郑州大学医学院人体解剖教研室提供)，在400倍视野下对切片计算血管密度。见图2(略)。

　　1.6 检测VEGF阳性表达的血管数 取石蜡包埋的内收肌和腓肠肌标本，按肌肉横断面切片，片厚5μm，免疫组织化学染色实验步骤按照SP9000二步法免疫组织化学检测试剂盒提供的说明书进行。血管内皮细胞胞浆染色呈棕黄色者为阳性细胞，该毛细血管即为VEGF阳性表达的血管。每一标本随机选取5个视野，在400倍显微镜下观察计数VEGF阳性表达的血管数，取其平均值。见图3(略)。

　　1.7 统计分析 所得数据用SPSS11.5软件分析，数据x±s表示，行成组资料用t检验(α=0.01)，以P<0.01为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大体观察 实验组兔麻醉意外死亡1只，术后2天内因肠梗阻死亡1只，对照组术后4d因腹泻死亡1只，余均存活。在观察时间段内未见后肢缺血性坏死，手术切口在术后4d均愈合良好。对照组出现跛行3只，下肢足背部溃疡1只;试验组各兔未出现跛行、溃疡。各兔均有左后肢毛发脱落现象。

　　2.2 侧支血管数 术后4周后兔行腹主动造影摄X线片，在X线片上经股骨中点画一条垂直于股骨纵轴的直线，记录通过该直线显示的血管数，试验组侧支血管数多于对照组，见表1。

　　2.3 毛细血管计数 使用图像分析系统在400倍视野下对切片进行统计血管密度，即试验组毛细血管数多于对照组，见表1。

　　2.4 VEGF阳性表达的血管数 在400倍显微镜下观察计数VEGF阳性表达的血管数，试验组VEGF阳性表达的血管数大于对照组，见表1。表1 两组VEGF阳性血管表达情况(略)

　　3 讨 论

　　外周动脉闭塞或狭窄引起的肢体缺血性疾病是外科常见的致残性疾病。尽管近年来血管成形术和外科搭桥术有了很大发展，但对远端流出道差或肢体动脉弥漫性病变的患者尚无有效疗法。血管新生(angiogenesis)[3]指在血管床的基础上血管内皮细胞的增生和迁移，即从先前存在的血管发芽生成新的毛细血管。血管新生疗法，就是通过应用外源血管生长因子(VEGF、bFGF等)或其原因，促进进缺血组织的血管新生和侧支血管的形成，使缺血得到改善的治疗方法。成纤维细胞生长因子(FGF)[4]，又称肝素亲和生长因子，按等电点不同分为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。bFGF的生物学活性远大于aFGF。bFGF是动物和人体组织中存在的一种微量蛋白，对多种中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛生物学活性，是一种多功能细胞因子[5]。bFGF可趋化血管内膜的各类细胞，并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂、胶原酶和蛋白水解酶等;这些酶类通过促使血管基底膜降解和刺激内膜各类细胞增殖与迁移，诱导血管内皮细胞长入胶原基质中形成管腔并促进神经元及新生血管共同生长[6]。研究发现干细胞在分化为血管内皮细胞的过程中能分泌bFGF[7]。bFGF等血管生长因子又可以促进干细胞增殖并向血管内皮细胞分化，诱导内皮细胞产生纤维酶原激活物和基质金属蛋白酶，从而降解基质，加速新生血管的管腔结构的形成和三维立体构像形成[8]。研究表明[9，10]，组织缺血后局部内源性bFGF蛋白表达增加，促进血管再生以适应缺血的变化，但这一过程非常缓慢，而且bFGF增加的量不足以完全改善组织缺血的状态。因此，在缺血组织内适时适量地增加局部外源性bFGF的量，将会加快血管新生的速度和加大血管新生的幅度，可能成为一条新的治疗缺血性疾病的途径。一些学者一直用bFGF基因治疗缺血性疾病的研究也取得了一定效果，但随着重组人bFGF蛋白的出现，应用bFGF蛋白治疗缺血性疾病将更加简单易行。研究表明[12 ，10， 11]，bFGF蛋白治疗心肌缺血同样能改善心肌功能，减少梗死面积，增加缺血区小动脉毛细血管数量等作用。本实验应用bFGF蛋白在兔缺血后肢肌肉内注射，侧支血管增加(试验组>对照组)，缺血状态得到改善。研究表明[11，12]，组织缺血后局部内源性VEGF蛋白表达增加以促进血管新生，代偿局部缺血状态。本实验表明，应用外源性bFGF蛋白可加大缺血组织内血管内皮细胞中VEGF蛋白的表达，使bFGF蛋白和VEGF蛋白共同加快缺血组织内毛细血管的新生速度和幅度。研究发现[11，13]bFGF有促进动脉生成的作用，本实验行兔腹主动脉造影显示的侧支血管均为动脉，试验组侧支血管(9.250±1.035)大于对照组(5.667±1.500)，证明bFGF的促动脉生成作用。

　　参 考 文 献

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　　郑州大学 1第一附属医院普外科

　　2第三附属医院妇产科 (河南 郑州 450052)