先天性巨结肠突触素免疫组织化学研究

　　作者：崔新海 陈雨历 张蕾 张唐山 刘园园

　　【摘要】目的：采用突触素免疫组织化学方法，对先天性巨结肠神经肌肉连接进行研究，并探讨其与先天性巨结肠发病的关系。方法：应用免疫组化技术对20例先天性巨结肠病变肠段及10例正常结肠组织标本行突触素神经肌肉连接标记，光镜下观察其免疫反应。结果：对照组的结肠突触素免疫反应呈强阳性表达，先天性巨结肠组扩张肠段突触素免疫反应呈阳性或弱阳性表达，狭窄段肠壁突触素免疫反应呈阴性表达。结论：先天性巨结肠病变肠段同时缺乏内源性神经支配和外源性神经支配，处于完全失神经支配状态，导致原神经节细胞病变肠管功能障碍。

　　【关键词】巨结肠，先天性?突触素

　　Immunohistochemical study of the synaptophysin in hirschsprung’s disease

　　CUI Xinhai1,CHEN Yuli2,ZHANG Lei1,ZHANG Tangshan3,LIU Yuanyuan1

　　1Department of Pediatric Surgery,Qilu Hospital of Shandong University(Jinan

　　250012,China)

　　2Department of Pediatric Surgery,Second Hospital of Shandong University(Jinan250033,China)

　　3Department of Surgery,Hospital of Jiyang County(Jinan 251400,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To study the neuromuscular junction of the colon in patients with Hirschsprung’s disease by immunohistochemical methods.Methods:The distribution of the neuromuscular junction in the muscle layers of bowel from 10 normal controls and 20 Hirschsprung’s disease patients was studied by synaptophysin immunohistochemistry.Antimouse synaptophysin serum was used for visualization of neuromuscular junction.Results:In the colon of the control cases，synaptophysinimmunoreactivity was widely distributed in the circular muscle layer.In the dilated colon with Hirschsprung’s disease cases,synaptophysinimmunoreactivity was moderately distributed within normal ganglion cell and scarcely in constricted segment within degenerated ganglion cell.In contrast to the high degree of synaptophysinimmunoreactivity in the controls and dilated colon,the synaptophysinimmunoreactivity in the constricted segment were nil in the circular muscle layer.Conclutions:Dense synaptophysinimmunoreactivity nerve endings were prominent in the circular muscle layer in the control and there was almost no synaptophysin imm〖HK140mm]unoreactivity activity in the circular muscle layer in the constricted segment.The circular muscle layer from the constricted segment is confirmed to be a region with poor innervation including extrinsic and intrinsic nerve. Based on the Cannon’s Law of Denervation,the muscles that are supplied by these nerves shorten and tighten,resulting in muscle spasm and stiffness.The constricted segment which was denervated,is incapable of transmitting normal propulsive peristaltic waves and therefore acts as a physiologic obstruction.

　　【KEY WORDS】Hirschsprung’s disease?Synaptophysin

　　近年研究已确定先天性巨结肠病变肠壁肠神经系统异常，包括节细胞和ckit细胞、副交感和交感神经、P物质和血管活性肽能神经、一氧化氮阳性神经丛缺乏，乙酰胆碱酯酶活性神经纤维增生，导致病变肠管功能障碍，但对病变的病理生理机制仍未完全明了[1]，对病变肠段动力学的影响尚有争论[2]。有报告认为，先天性巨结肠病变段层粘连蛋白增高引起肠神经细胞过早分化、定居导致无神经节细胞症的发生[3]。本研究采用免疫组化方法，研究突触素对先天性巨结肠神经肌肉连接探讨其与先天性巨结肠发病的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 本组20例临床诊断为先天性巨结肠症，术后病理诊断符合先天性巨结肠，病理资料完整。每例采集狭窄段和扩张段组织蜡块各1块。患者年龄90d~10岁，男13例，女7例。短段型5例，普通型12例，长段型3例。术后病理证实根治术切除的结肠近端肠壁内均可查到神经节细胞。10例正常结肠组织标本(来自尸检)取自我院病理科存档蜡块作为对照。

　　1.2 方法 取正常结肠及先天性巨结肠狭窄段和扩张段标本，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，行突触素免疫组化染色。抗体为北京中山生物试剂公司产品，染色步骤采用SP法，光学显微镜观察突触素免疫组化染色结果。

　　2 结 果

　　2.1 结果判定 光镜下观察，突触素分布于肠壁环形平滑肌层肌细胞间。变性的神经节细胞表现为细胞境界不清，部分节细胞细胞核消失。突触素的免疫反应分布密度按以下标准进行半定量分级：-(阴性)：无阳性免疫反应存在;+(弱阳性)：环行平滑肌层有少量阳性表达，分布密度低;++(阳性)：环行平滑肌层有中等量的免疫反应阳性表达;+++(强阳性)：环行平滑肌层有大量的免疫反应阳性表达。

　　2.2 突触素免疫反应表达 对照组突触素免疫反应呈强阳性表达1。先天性巨结肠组扩张肠段，突触素的免疫反应与神经节细胞的形态密切相关。在神经节细胞基本正常的环形平滑肌层，突触素免疫反应呈阳性表达，在神经节细胞变性的环形平滑肌层，突触素免疫反应呈弱阳性表达。狭窄段肠壁神经节细胞缺乏，其环形平滑肌层突触素的免疫反应呈阴性表达。

　　2.3 突触素表达与病变肠段关系 见表1。

　　3 讨 论

　　突触是神经元间信息传递的特化结构，在突触前膜，神经递质贮存在突触囊泡内。突触囊泡是一类非常小且高度特化的细胞器，功能是贮存和释放神经递质。目前已知的突触囊泡蛋白有数种，其中突触素参与突触囊泡的导入、转运和神经递质的释放、突触囊泡再循环和突触发生，可作为突触前终末的特异性标记物，用来检测突触的密度和分布[3]。突触密度在研究神经系统的结构和功能中是一个很重要的参数，因此突触素可作为突触的特异标记物之一。表1 不同病变肠段突触素表达(略)

　　20世纪70年代，Howard和Baumgarten的研究提示，在先天性巨结肠的无神经节细胞肠段中存在丰富的突触[5，6]。Tam在1986年通过使用免疫组化的方法，报告在先天性巨结肠无神经节细胞肠段的神经束中能检测到很强的神经元特异性烯醇酶活性，提示了这些密集的神经丛可能与平滑肌形成大量的突触，而不是象被截断一样形成盲端[7]。Yamataka采用抗突触囊泡蛋白的单克隆抗体进行先天性巨结肠神经末梢分布的免疫组化研究，发现无神经节细胞段肠壁突触的分布与正常结肠相比明显缺乏，指出无神经节细胞段肠壁增生的外源神经纤维可能没有通过神经肌肉接头终止于平滑肌细胞[8]，在先天性巨结肠病人的无神经节细胞肠段中虽然有神经纤维的增生，但是神经支配却很差[9]。近年Masato nagahama对患有先天性神经节细胞缺乏症小鼠的动物模型用突触素进行了大肠及小肠周围神经末梢分布的光学显微镜及电子显微镜研究[10]，发现扩张肠管区域，突触素的免疫反应存在于肠壁的各层，而在狭窄的末端回肠及近端结肠肠壁的各层包括环形平滑肌层及纵形平滑肌都缺乏这种反应，超微结构的研究证实在任何一段狭窄肠壁的环形平滑肌层都没有发现神经末梢的存在。nogueira[11]对17名患者进行直肠及全层结肠活检，采用的组织化学和免疫组化方法，发现先天性巨结肠无神经支配的节段存在非常密集的乙酰胆碱酯酶反应;相反，神经元细胞粘附因子及突触素免疫反应神经纤维却显著减少。Morri等[12]对发育中的小鼠小脑皮质内ckit受体及其配位子的研究结果提示，ckit受体及其配位子的相互作用对突触的形成起了关键作用。临床上对肌源性慢性特异性假性肠梗阻患者肠道的病理检查结果显示，患者肠壁内ckit阳性的Cajal间质细胞的数目明显减少，提示两者间质细胞的减少或缺失是先天性巨结肠的病理改变之一。本研究应用突触素对先天性巨结肠患儿及正常儿结肠壁神经肌肉连接进行标记，正常对照组的结肠肠壁突触素免疫反应广泛存在。在先天性巨结肠组扩张肠段，突触素免疫反应与神经节细胞的形态密切相关。在神经节细胞基本正常的环形平滑肌层，存在阳性突触素免疫反应，在神经节细胞变性的环形平滑肌层，突触素免疫反应则呈弱阳性表达。在巨结肠狭窄肠壁神经节细胞缺乏，其环形平滑肌层突触素的免疫反应呈阴性表达，结果表明，肠壁的神经末梢―神经节细胞节后纤维和神经肌肉连接与神经节细胞密切相关。狭窄段肠管内源性的神经节细胞缺乏，其内源性神经末梢亦缺乏，同样狭窄段环形平滑肌神经肌肉连接的缺乏也证明了尽管外源性的副交感神经纤维在病变的狭窄段大量增生变粗，但却没有与环形平滑肌建立神经肌肉连接，因此先天性巨结肠狭窄段肠壁的环形平滑肌同时缺乏外源性及内源性神经支配，处于失神经支配状态。目前已确定先天性巨结肠无神经节细胞段环形平滑肌持续痉挛导致病变段肠功能障碍，但其病理生理尚有争论。Okasora研究证实[13]，无论是胆碱能受体或肾上腺能β受体的含量均较正常肠段明显减少，从而造成病变肠管及内括约肌痉挛狭窄和缺乏正常的蠕动功能，形成功能性肠梗阻。Touloukian等[14]认为，肾上腺能神经功能亢进导致无神经节段肌张力增强和蠕动异常。另有学说认为，本应与神经节细胞建立突触联系的副交感神经节前纤维在无神经节细胞的肠段大量增生变粗，交感神经节后纤维亦明显增多，大量释放乙酰胆碱是引起肠段痉挛的主要原因之一。近年来Rolle[15]认为病变段Cajal间质细胞(起搏细胞)减少或缺如，使肠神经系统与平滑肌间的电信号传递障碍造成了肠功能异常。此外还有第三神经系统缺如说学说和无神经节细胞段的痉挛与NO神经缺乏有关学说等。我们的研究发现，先天性巨结肠狭窄段肠壁的环形平滑肌同时缺乏外源性及内源性神经支配，处于失神经支配状态。另外胃肠肌电研究发现，先天性巨结肠无神经节细胞段的肌电图无峰波，均为持续小而平的慢波，且对各种刺激无肌电反应，直肠肛管测压表现为狭窄段无松驰反射，也说明无神经节细胞肠段，没有任何其它肌电反应，处于完全失神经支配状态。美国著名的生理学家Cannon发现，失去神经支配的平滑肌因处于痉挛状态而僵硬无蠕动，且对刺激异常敏感。其研究结果被后人承认并称为Cannon定律，即切除神经的肠管平滑肌对刺激异常敏感，并倾向持续性痉挛[16]。人类结肠运动的形式主要分为袋状往返运动、分节推进运动、多袋推进运动和蠕动，结肠内容物由近端向远端的单向运动主要由多袋推进运动和蠕动两种形式完成，而这两种运动形式均需要近端结肠平滑肌收缩的同时远端平滑肌协调地松驰。先天性巨结肠无神经节细胞段平滑肌因处于失神经支配状态，根据Cannon定律，其环形平滑肌发生持续性痉挛而不能主动松驰，故正常的多袋推进运动和蠕动行进到病变段则因其平滑肌不能松驰而停止，从而导致无神经节细胞肠段病变肠管功能障碍。突触素是肠神经末梢特异性较高的标志物，对肠神经节细胞节后纤维及平滑肌神经肌肉连接均有阳性免疫反应，其染色结果容易观察和判断，故突触素者的免疫组织化学染色将为先天性巨结肠及其同源病的诊断提供新的方法。

　　参 考 文 献

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　　[16]Ozdil T,Rowe CD,Harris R,et al.A demonstration of law of denervation after repeated stellate ganglion blocks [J].J Tenn Med Assoc,1969,62:413417.

　　1山东大学齐鲁医院 小儿外科 (山东 济南 250012)

　　2山东大学第二医院 小儿外科 (山东 济南 250033)

　　3山东省济阳县人民医院 外科 (山东 济阳 251400)