大黄对失血性休克大鼠小肠粘膜组织中一氧化氮合酶和内皮素表达的影响

　　作者：刘郁，段绍斌，姚华，马林杰，张增峰，王宏 作者单位：新疆医科大学附属中医医院普外一科, 公共卫生学院, 新疆 乌鲁木齐 830000

　　【摘要】 目的: 研究大黄对失血性休克大鼠再灌注后小肠粘膜组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮素(ET)表达的影响。方法：雄性SD大鼠36只随机分成对照组(不进行休克处理)、模型组(再灌注前胃管注入生理盐水10 ml/kg)、大黄组(再灌注前胃管注入大黄液，大黄20 g/kg)。复制失血性休克及复苏大鼠模型 ,大黄于术前胃管注入 ,造模完成后观察各组大鼠小肠粘膜病理学变化 ,用免疫组化法检测肠粘膜组织iNOS和ET的表达。结果: 肠粘膜损伤程度分级以对照组最轻，模型组最重，大黄组居中，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、模型组、大黄组Chiu′s 评分分别为(0.33±0.78)、(3.63±0.74)、(0.97±0.69)分，模型组和大黄组明显高于对照组(q值分别为15.498 6、3.005 8, P<0.05 ),大黄组明显低于模型组(q=12.492 8, P<0.05)。模型组 iNOS表达明显高于对照组、大黄组(q值分别为4.114 3、3.448 2，P<0.05)，大黄组比对照组有增高趋势 ,但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组和大黄组 ET表达水平高于对照组(q值分别为4.798 2、4.198 4，P<0.05),与模型组相比,大黄组肠粘膜 ET 表达虽有所降低 ,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论: 　大黄能抑制失血性休克再灌注小肠粘膜组织iNOS的表达而起到保护肠粘膜的作用。

　　【关键词】 失血性休克; 再灌注损伤; 小肠粘膜; 大黄; 一氧化氮合酶; 内皮素

　　Expression of nitric oxide synthase and endothelin-1 in small intestinal mucosa in haemorrhagic shocked rats and affection of rhubarb on them

　　LIU YU，DUAN Shao-bin, YAO Hua, et al

　　(Department of General Surgery, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

　　Abstract：　Objective： To observe the expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and endothelin-1 (ET-1) in the small intestinal mucosa of hemorrhagic shock rats after reperfusion and affection of rhubarb on them.Methods： Thirty-six male SD rats were randomly divided into three groups，Control group，without shock; model group，before reperfusion 10 ml/kg saline stomach injection; rhubarb group，reperfusion stomach before injection of rhubarb, rhubarb 20 g/kg.Copy hemorrhagic shock and resuscitation rats，Rhubarb in the preoperative stomach implantation, model after completion of treatment of small intestinal pathology changes, immunohistochemical detection of intestinal mucosa of inducible expression of iNOS and ET.Results： Mucosa damage to the control group graded the lightest, most model group, the middle group of rhubarb, Each group had a significant difference (P<0.05).Chiu′s score control group, model group, rhubarb group (0.33±0.78) (3.63±0.74), (0.97±0.69), and rhubarb model group was significantly higher (P<0.05).Rhubarb group was significantly lower than the model group (P<0.05).Model group iNOS expression was significantly higher than the other two groups (P<0.05), rhubarb group than the control group increased trend, but the difference between the two groups was not significant (P>0.05).Rhubarb model group and the level of expression of the ET control group (P<0.05), compared with the model group, rhubarb group, although the expression of intestinal ET lower, but the difference was not statistically significant (P>0.05).Conclusions： Rhubarb can inhibit hemorrhagic shock and reperfusion of the small intestinal mucosa iNOS expression organizations play the role of intestinal mucosal protection.

　　Key words：　haemorrhagic shock; reperfusion injury; small intestinal mucosa;　rhubarb;　nitric oxide synthase;　endothelin-1

　　近年研究发现 ,失血性休克再灌注后肠粘膜损伤与一氧化氮(NO)及内皮素(ET)有关 , NO 是一种血管内皮衍生的舒张因子, 而ET为一种强效血管收缩剂, NO和ET起着调节血管内皮功能的作用[1]，它们之间平衡的改变在肠粘膜损伤中发挥着重要的作用[2]。目前有关缺血-再灌注损伤中肠粘膜诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase , iNOS)和 ET 表达情况研究不深入,以往陈德昌等[3]研究结果表明大黄具有抗失血性休克再灌注肠粘膜损伤的作用。本实验通过观察大黄对失血性休克大鼠肠粘膜iNOS和 ET表达的影响,从而阐明大黄抗失血再灌注肠黏膜损伤作用,为临床防治失血再灌注肠黏膜损伤提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验试剂、动物及分组 大黄粉(江阴天江药业有限公司生产),兔抗大鼠iNOS 多克隆抗体、抗大鼠ET-1多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司,通用型二步法染色试剂盒及DAB 购自北京中山生物技术有限公司。36只雄性SD大鼠，体重200～250　g，由新疆医科大学动物实验中心提供，随机分为对照组、模型组、大黄组3组。

　　1.2 实验方法 大鼠禁食不禁水12 h, 10%水合氯醛0.3 ml/kg 腹腔注射麻醉，无菌操作下行左侧颈动脉插管及右侧颈静脉插管 (用10 U肝素生理盐水冲洗导管)，动脉导管经压力传感器与心电监护仪相连, 持续监测动脉压和心电图。平衡30 min后, 由静脉导管缓慢放血, 15 min达到目标血压[平均动脉压达513 kPa(1 kPa=715 mmHg)], 维持1 h, 休克末将失血回输, 对照组不进行休克处理,模型组再灌注前胃管注入生理盐水10 ml/kg, 大黄组再灌注前胃管注入大黄液(大黄20 g/kg)，2 h后结束实验。迅速开腹,回肠末端5 cm 处取1.0 cm 肠段一份,随即置入4 %的多聚甲醛液中固定24 h,制备切片,HE染色镜下观察，对肠粘膜进行绒毛和腺体损伤程度分级并采用免疫组化法检测肠粘膜组织中iNOS和ET-1的表达。

　　1.3 结果判断

　　1.3.1 病理组织学观察 镜下观察，对肠粘膜进行绒毛和腺体损伤程度分级。正常:正常绒毛;轻度损伤:顶部部分绒毛脱落;中度损伤:绒毛脱落明显,上皮与固有层中度分离;重度损伤:绒毛脱落明显,固有层绒毛脱落。Chiu′s 评分标准[4]: 0分：正常绒毛和腺体;1分：部分绒毛顶部的变化上皮下Gruenhagen′s 腔开始形成;2分：上皮下Gruenhagen′s 腔形成,腺体轻度受损;3分：上皮下间隙扩大,毛细血管充血;4分：上皮与固有层中度分离,腺体受损;5分：部分顶部绒毛脱落;6分：绒毛脱落明显,毛细血管扩张;7分：固有层绒毛脱落,腺体受损明显;8分：固有层开始消失、分解;9分：出血、溃疡。

　　1.3.2 iNOS和ET-1的表达 各组肠组织切片采用免疫组化二步染色法染色,封片镜检,棕色颗粒为阳性产物。在400倍显微镜下用HPIAS-1000 型医学彩色图像分析系统测量iNOS、ET-1光密度值(optical density ,OD值),每组选24个视野(每组12只大鼠各取一张切片,每张切片取2个视野) 分别测量,然后计算OD值的均值作为此组的代表值。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包对数据进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组均数比较采用单因素方差分析的方法, 均数间两两比较采用q检验;等级资料的比较用秩和检验，多重比较采用Kruskal-Wallis秩和检验法，组间比较用Wilcoxon秩和检验法,检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 镜下观察 对照组肠粘膜结构无明显损伤性组织学改变(图1);模型组绒毛水肿明显,大量粘膜上皮细胞脱落,绒毛和腺体明显受损,部分出现溃疡(图2);大黄组绒毛轻度水肿,少量粘膜上皮细胞脱落,绒毛受损轻度,腺体基本正常,部分轻度受损(图3)。

　　2.2 3组大鼠失血再灌注后小肠粘膜损伤程度的比较 肠粘膜损伤程度分级以对照组最轻，模型组最重，大黄组居中，各组间差异有统计学意义(Hc=30.234 9, P<0.05)。对照组、模型组、大黄组Chiu′s评分分别为(0.33±0.78)、(3.63±0.74)、(0.97±0.69)分，模型组和大黄组明显高于对照组(q分别为15.498 6、3.005 8，P<0.05 )，大黄组明显低于模型组(q=12.492 8，P<0.05)(表1)。

　　表1 大鼠失血再灌注后小肠黏膜损伤程度比较(略)

　　2.3 3组大鼠肠粘膜组织中iNOS、ET-1的表达 免疫组化结果显示发现iNOS 表达阳性细胞为胞浆内棕黄色颗粒,可见于粘膜上皮、肠腺腺腔、粘膜下层血管内皮,同时在粘膜表面及肌层也可见黄染产物。模型组iNOS表达明显高于对照组、大黄组(q分别为4.113 4、3.448 2，P<0.05)。大黄组比对照组有增高趋势,但两组间差异无统计学意义(q=0.665 2，P>0.05)(表2)。　ET- 1 表达阳性为棕黄色颗粒,主要见于粘膜下层、粘膜上皮、粘膜表面及肌层可见少量黄染。模型组和大黄组ET-1 表达高于对照组(q分别为4.798 2、4.198 4，P<0.05),与模型组相比,大黄组肠粘膜ET-1 表达虽有所降低,但差异无统计学意义(q=0.598 8，P>0.05)(表2)。

　　表2 3组大鼠小肠粘膜组织中iNOS、ET-1表达的比较(略)

　　注： 与对照组比, *P<0.05，**P<0.01; 与模型组比, △P<0.05

　　图1 对照组肠粘膜无明显损伤(略)

　　图2 模型组绒毛水肿明显，绒毛和腺体明显受损(略)

　　图3 大黄组绒毛轻度水肿，受损程度轻，腺体基本正常(略)

　　3 讨论

　　休克、创伤后肠粘膜缺血、再灌注引起的肠粘膜结构和功能的损伤是导致顽固性休克及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS) 的重要原因。肠粘膜是肠道乃至整个机体代谢最活跃的部位,且因其血管为夹状结构及逆流交换机制,使肠粘膜最易受缺血、再灌注等病理因素影响。目前,肠道尤其是肠粘膜损伤的保护已成为休克、创伤后综合治疗研究的热点。失血性休克再灌注可引起肠粘膜再灌注损伤,抗失血性再灌注肠粘膜损伤是减少细菌毒素易位造成的多器官衰竭的重要手段[5]。祖国医学认为大黄具有清热、抗炎、通便的功效[6]，近来研究证明其对胃肠黏膜也有明显保护的作用[7，8]，它可提高脓毒症患者胃肠黏膜内pH值，改善胃肠道血流灌注，缓解胃肠黏膜缺血缺氧,动物实验表明其可促进胃肠黏膜内杯状细胞增生，清除氧自由基，抑制细菌移位。本实验结果发现, 模型组小肠粘膜损伤极为明显,中药大黄能减轻失血性休克再灌注肠粘膜损伤,与陈德昌等[3]研究结果相符,进一步证实大黄具有抗失血性休克再灌注肠粘膜损伤的作用。

　　内源性的NO是由NOS氧化L-精氨酸产生，NOS有3种亚型，神经元型NOS、内皮型NOS和iNOS。在病理状态下，iNOS 产生大量NO，过量的NO可引起过氧化损伤或作为信号介导其它炎症因子起作用，从而在多方面损伤组织。Weisbrodt等[9] 研究显示在大鼠失血性休克复苏后90 min,小肠iNOS 表达增强,血浆NO水平明显增高,并认为再灌注损伤与iNOS 大量表达及NO过量增加有关。本研究表明:在缺血再灌注时,大鼠小肠粘膜内iNOS的表达增加,粘膜损伤加重，而用大黄预处理后, iNOS 的表达明显被抑制,粘膜损伤显著减轻,提示大黄能抑制小肠缺血再灌注后肠粘膜的iNOS 表达,有利于减少NO产生,从而发挥其抗损伤作用。

　　ET是一类有21 个氨基酸残基的多肽,是一种强烈的血管张力调节因子, 具有极强的血管活性, 在胃肠粘膜损伤中具有重要作用,其功能非常复杂,分布广泛。Kurihara等[10] 研究内毒素休克和创伤性模型发现:肝脏、心脏、肺等组织中ET表达增加,表明ET 的增加在组织损伤中发挥着重要作用。本实验结果发现,在大鼠失血性休克再灌注损伤中, 肠粘膜内ET的表达增加,粘膜损伤加重，大黄虽有降低ET表达的趋势,但与模型组比差异无统计学意义,提示大黄对ET表达的影响在大黄抗失血性休克再灌注肠粘膜损伤中所起作用尚待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Pannen BH.New insights into the regulation of hepatic bloodflow after ischemia and reperfusion[J].Anest Analg, 2002, 94:1448-1457.

　　[2] 吴承堂，黎沾良.一氧化氮、内皮素在急性坏死性胰腺炎肠道损伤中的作用[J].中国普通外科杂志，1999，8(3):210-212.

　　[3] 陈德昌, 景炳文.大黄对大鼠肠粘膜及肠血管通透性的影响[J].中国危重病急救医学,1996.8(8): 449-451.

　　[4] Chiu CJ, Mcardle AH, Brown R, et al.Intestinal mucosal lesion in low-flow states[J].Arch Surg,1970,101(4):478-483.

　　[5] Fujino Y, Suzuki Y, Kakinoki K, et al.Protection against experimental small intestinal ischaemia reperfusion injury with oxygenated perfluorochemical[J].Br J Surg, 2003,90:1015-1020.

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　　[7] 刘 峰,高士杰,胡慧刚,等.大黄治疗休克后胃肠功能障碍的临床研究[J].中国急救医学,2003,23(1):38-39.

　　[8] 王兴鹏.现代胃肠病学高级进修教程[M].上海:上海科学技术文献出版社,2001.47-58.

　　[9] Weisbrodt NW, Hassoun HT, Mercer DW, et al.Inducible nitric oxide synt- hase mediates gut ischemia/ reperfusion induced only after severe insults[J].Surg Res,2001,97:150-154.

　　[10] Kurihara H, Shindo T, Kurihara Y, et al.Upregulation of endothelin-1 and adrenomedullin gene expression in the mouse endotoxin shock model[J].Cardiovasc Pharmacol, 1998,31(suppl1):541-544.