谷氨酰胺强化肠外营养对大鼠小肠黏膜缺血再灌注损伤的影响

谷氨酰胺强化肠外营养对大鼠小肠黏膜缺血再灌注损伤的影响作者：彭利盼　李乐平　靖昌庆　孙景福    作者单位：山东大学附属省立医院　胃肠外科　（山东　济南　250021）    【摘要】  目的：构建大鼠小肠缺血再灌注模型，观察谷氨酰胺强化肠外营养对小肠黏膜屏障作用的影响，并探讨其作用机制。方法：30只雌性Wistar大鼠，随机分为正常对照组（N组）、传统肠外营养组（TPN组）和谷氨酰胺强化肠外营养组（TPN+Gln组）3组，每组10只。TPN组和TPN+Gln组构建小肠缺血再灌注模型后予完全肠外营养5 d。观察3组小肠黏膜形态、血浆D-乳酸、内毒素、TNF-α、IL-6水平及小肠黏膜HO-1 mRNA和蛋白的表达。结果：TPN+Gln组与TPN组相比，小肠黏膜组织形态明显改善，血浆D-乳酸、内毒素、TNF-α和IL-6水平均显著性降低，HO-1 mRNA及蛋白表达水平明显增高。结论：谷氨酰胺强化肠外营养可以明显减轻大鼠缺血再灌注小肠黏膜屏障损伤及炎性反应，保护黏膜屏障完整性，并促进HO-1 mRNA表达及HO-1合成。HO-1及其代谢产物的抗氧化、抗凋亡及抗炎作用可能是谷氨酰胺保护缺血再灌注损伤小肠的作用机制。    【关键词】  胃肠外营养·谷氨酰胺·再灌注损伤·小肠·大鼠，Wistar    Effects of glutamine enriched parenteral nutrition on mucosal ischemia and reperfusion injury of small bowel in rats PENG Li-pan, LI Le-ping, JING Chang-qing, SUN Jing-fu　Department of Gastrointestinal Surgery, Affiliated Provincial Hospital of Shandong University （Jinan 250021, China）　　【ABSTRACT】 Objective: Small bowel IRI models in rats were established to explore the effect of glutamine enriched parenteral nutrition on mucosal barrier, and to discuss the probable mechanisms. Methods: Thirty Wistar rats were randomly assigned into 3 groups: The control group （N group, n=10）, conducted fictitious operation and fed with common forage, TPN group （n=10） and TPN+Glu group（n=10）. The morphous of mucous, serum and intestinal mucosal Gln concentration, levels of D-lactate, endotoxin, TNF-α, IL-6, HO-1 positive ratio and HO-1 mRNA were detected. Results: Glutamine obviously improved the structure of intestinal mucosal and decreased the expressions of D-lactate, endotoxin, TNF-αand IL-6. And enhanced the expressions of HO-1 mRNA and HO-1. Conclusion: Glutamine enriched parenteral nutrition can alleviate small intestinal IRI and inflam matory reaction and enhance the HO-1 and HO-1 mRNA expressions. HO-1 and its metabolin's　　全胃肠外营养（total parenteral nutrition，TPN）能够为无法经胃肠道摄食的患者提供有效的营养支持。但由于传统营养液配方中缺乏营养肠黏膜细胞的物质等原因，TPN不可避免地造成小肠黏膜一定程度的萎缩和功能低下［1］。谷氨酰胺（glutamine，Gln）是小肠黏膜细胞、淋巴细胞等增生代谢旺盛细胞的主要能源［2］。在严重创伤、感染及应激状态下，机体对Gln的消耗大量增加。本研究通过构建大鼠小肠缺血再灌注模型，观察Gln强化的TPN对缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）大鼠的肠黏膜结构及其屏障作用的影响，并尝试揭示Gln的作用机制，为临床应用提供实验依据。1　材料与方法　　1.1　动物分组及模型构建　　　6～8周龄雌性Wistar大鼠（山东大学实验动物中心提供）30只，体质量175~220 g，平均（195.3±6.8）g。室温下常规混合饲料适应性喂养5 d。　　30只大鼠随机分为3组：正常对照组（N组），传统肠外营养组（TPN组）和谷氨酰胺强化肠外营养组（TPN+Gln组），每组10只。　　适应性喂养5 d后，以10%水合氯醛（3.0 mL/kg）腹腔内注射麻醉，无菌条件下经腹正中切口入腹，暴露肠系膜上动脉。N组只轻柔地翻动空肠数次后置回腹腔；另外2组用无创动脉夹夹闭肠系膜上动脉30 min，松开止血夹再灌注4 h后关腹。3组均行上腔静脉置管。参照Steiger等［3］的方法，取右侧前纵行切口，暴露颈外静脉后将硅胶管向心插入1.0～1.5 cm，达上腔静脉后固定，导管经皮下隧道自颈背部引出。插管过程中滴注生理盐水以免导管内血栓或气栓形成。并肌内注射青霉素30 mg。　　置管当日起，TPN组和TPN+Gln组予以完全TPN，经静脉置管给予营养液；N组以常规饲料喂养，每日从静脉置管滴入生理盐水5 mL，保持置管通畅。3组大鼠均喂养5 d后剖杀取材。　　　　1.2　营养液配制　　　营养液包括50%葡萄糖溶液、20%脂肪乳溶液、8.5%复方氨基酸、胰岛素、维生素和电解质溶液。其中糖脂比（糖脂供能与总能量之比）2∶1，热氮比为438 kJ∶1 g，葡萄糖和胰岛素之比为5 g∶1 U，由微量泵匀速滴入。TPN组每天给予热量105 kJ·kg-1·d-1，TPN+Gln组在上述营养液的基础上，按0.5 g·kg-1·d-1予以20%L-丙胺酰-L-谷氨酰胺溶液（华瑞制药有限公司提供，静脉输注后迅速分解为Gln和丙氨酸），剩余氮量由氨基酸溶液提供，保证总氮量和TPN组相同［4］。　　1.3　观察指标　　1.3.1　血浆Gln、D-乳酸和内毒素浓度测定　　　剖杀前抽取静脉全血3 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，提取上清，采用高效液相色谱仪测定Gln，改良的酶学分光光度法检测血浆D-乳酸，偶氮显色鰲试剂法测定血浆内毒素水平。　　1.3.2　小肠黏膜形态与Gln水平检测　　　距Treitz韧带远端5 cm处取空肠标本2段，沿肠系膜缘纵向切开。一段用4%甲醛固定后，石蜡包埋固定、切片，常规HE染色，光学显微镜下观察小肠黏膜厚度、绒毛高度、陷窝深度等。另一段用冰盐水漂洗后刮取黏膜组织约0.2 g，电子称称量质量，按1∶10加入4 ℃生理盐水并手工研碎，匀浆预处理后用高效液相色谱仪测定Gln含量。　　1.3.3　血浆TNF-α和IL-6的测定　　　采用ELISA法，严格按试剂盒（购自武汉博士德公司）说明操作。　　1.3.4　免疫组织化学法检测血红氧和酶-1（HO-1）的表达　　　鼠抗人HO-1单克隆抗体、稀释型SABC免疫组织化学试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司。检测方法按照试剂盒操作说明进行。HO-1阳性细胞表达为棕黄色颗粒，呈颗粒状或片状，主要存在于细胞质中，细胞膜上也有少量表达。光学显微镜下随机选取10个连续不重复的高倍（×400）视野，计算阳性细胞率，阳性细胞率=阳性细胞数/总细胞数，取其均数。　　1.3.5　RT-PCR法检测肠黏膜HO-1 mRNA的表达　　　　用Trizol法提取小肠黏膜组织RNA。紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度，每例标本取总RNA 5 μg。按照试剂盒（购自Fermentas公司）操作说明合成第1链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。HO-1正义序列：5’-GCTTCACATAGCGCTGCA-3’，反义序列：5’-CAGGCAGAGAATGCTGAGTTC-3’，产物长度269 bp；β-肌动蛋白（β-actin）正义序列：5’-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3’，反义序列：5’-CTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGG-3’，产物长度333 bp。各引物均由上海生工（Sangon）合成，PCR试剂盒购自TaKaRa公司。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共扩增35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察，并用Alpha Imager 2200凝胶成像系统进行扫描分析，结果以HO-1吸光度的比值表示相对表达强度。　　1.4　统计学处理　　　采用SPSS15.0统计软件包进行分析，所有数据以x±s表示，组间比较行t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。2　结果　　实验过程中，N组大鼠均存活，TPN+Gln组中1只大鼠因静脉置管脱落被剔除，TPN组1只大鼠于术中死亡。　　2.1　血浆及小肠黏膜Gln含量　　　TPN组血浆及小肠黏膜Gln含量均明显低于N组；TPN+Gln组则明显高于TPN组和N组（P均＜0.05，表1）。　　2.2　小肠黏膜形态观察　　　N组黏膜形态基本正常。TPN组小肠黏膜基底膜水肿，绒毛血管扩张、广泛充血，绒毛变矮，轮廓欠清晰，皱襞少、低平，上皮细胞大小不一，排列紊乱，可见细胞变性、坏死、部分脱落等改变，黏膜上皮及固有层可见多量淋巴细胞及散在中性粒细胞浸润，隐窝变浅，隐窝细胞可见变性、坏死。TPN+Gln组小肠黏膜组织形态与TPN组相比，情况明显改善，绒毛血管仍有充血，轮廓基本正常，上皮及固有层可见少量淋巴细胞，偶见1～2个中性粒细胞，未见明显细胞坏死（图1）。　　2.3　血浆D-乳酸、内毒素、TNF-α和IL-6水平　　　N组D-乳酸、内毒素水平均低于其他2组（P＜0.05），而TPN+Gln组D-乳酸和内毒素水平明显低于TPN组（P＜0.05，表2）。　　N组血浆TNF-α和IL-6水平最低，TPN组明显增高（P＜0.05），TPN+Gln组则较TPN组降低（P＜0.05，表2）。　　2.4　小肠黏膜HO-1的表达　　　3组大鼠小肠黏膜组织中均有HO-1表达。N组HO-1阳性率为（10.2±1.6）%，TPN组和TPN+Gln组表达明显增高，分别为（21.7±2.1）%和（36.3±2.7)%（图2，表3）。　　2.5　小肠黏膜HO-1 mRNA表达　　　HO-1 mRNA大小为269 bp，β-actin为333 bp。通过成像系统扫描分析，3组均有HO-1mRNA表达，TPN+Gln组较TPN组和N组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。3　讨论　　正常的肠黏膜屏障包括机械、生物、化学和免疫屏障，其中最主要的肠黏膜上皮屏障对缺血不耐受。当机体发生严重应激反应时，小肠可因血液灌注不足而发生IRI，严重影响小肠屏障功能。长期传统TPN营养液由于配方中缺乏肠黏膜细胞的营养物质等原因，使得肠黏膜发生不同程度的结构萎缩和屏障功能降低［5］。Gln作为肠黏膜的主要供能物质，主要在小肠中进行代谢，具有促进氮平衡、保持肠黏膜完整、防止细菌移位和内毒素进入血液、增加肠免疫功能等诸多功效［6］。在饥饿、创伤、短肠综合征、放化疗、小肠移植等病理状态下，Gln消耗大大增加，体内Gln缺乏，从而诱发或加重肠黏膜损伤。　　本研究TPN组光学显微镜下病变主要表现为肠黏膜部分绒毛顶端上皮脱落、绒毛变矮、轮廓欠清晰、皱襞少而低平，毛细血管内广泛充血，上皮及固有层可见大量淋巴细胞及散在中性粒细胞浸润，而黏膜下及肌层未见明显变化。TPN+Gln组肠组织形态基本正常，绒毛高度、表面积明显高于TPN组，上皮及固有层内可见少量淋巴细胞，偶见中性粒细胞。说明Gln作为肠黏膜细胞的能源物质，对肠黏膜屏障具有保护作用。　　内毒素和D-乳酸是肠道内细菌的分解产物，正常情况下，局限于肠腔内，很少进入血液，当肠道发生急性缺血等损伤，肠黏膜通透性增加时，血浆内毒素和D-乳酸水平将升高，故血浆中内毒素及D-乳酸水平可以及时反映肠黏膜损害程度及通透性变化。本研究显示N组内毒素和D-乳酸水平均低于TPN组和TPN+Gln组，可见缺血再灌注已造成小肠黏膜屏障作用明显受损；而TPN+Gln组水平明显低于TPN组，说明外源性补充谷氨酰胺可以明显降低小肠黏膜的IRI。　　为探讨Gln对全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response synlrome，SIRS）的影响，本研究选择了血浆TNF-α和IL-6作为炎性反应指标。血浆TNF-α和IL-6水平对判断早期细菌感染和炎性反应有较好的敏感性和特异性［7］。本研究发现TPN组和TPN+Gln组TNF-α和IL-6均高于N组水平，提示小肠缺血再灌注导致肠黏膜屏障破坏，肠道内细菌、内毒素移位诱发炎性反应；TPN+Gln组TNF-α和IL-6水平较TPN组明显降低且差异有统计学意义，提示外源性补充Gln能减少炎症因子的释放，对肠源性感染和SIRS进程有一定的抑制作用。　　HO-1是诱导型血红氧和酶，亦称热休克蛋白32（heat shock protein 32，HSP32），是细胞和组织对应激和损伤产生反应的基础物质，被认为是细胞应激的主要敏感指标之一［8］。HO-1过表达可能代表一种针对应激性刺激的外源性调节机制，保护细胞免于应激性伤害。研究证实，在包括移植物排斥和IRI的多种病理情况下，HO-1表达上调均具有重要的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用［9］。Uehara等［10］在大鼠脓毒症造模前9 h静脉给予Gln，发现脂多糖诱导的肠上皮细胞凋亡和黏膜损伤显著改善，存活率升高，而使用了锡－中卟啉（tin mesoporphyrin，SnMP）的实验组Gln的保护作用全部消失。SnMP是HO-1的竞争性抑制剂，由此推测Gln通过对肠道HO-1的诱导而发挥保护作用。近期实验发现，在HSF-1基因缺如的细胞中，Gln诱导产生HSP的反应消失，Gln的肠道保护作用也丧失［11］。本研究结果显示，TPN+Gln组肠粘膜HO-1阳性细胞率及HO-1 mRNA表达水平均高于TPN组，证实Gln对IRI小肠黏膜细胞HO-1表达具有上调作用，可能是Gln肠屏障保护功能的作用机制之一。　　此外，Gln还可能通过以下途径保护肠黏膜：1）Gln可在肠黏膜细胞内氧化生成ATP，为肠黏膜上皮细胞提供能源；2）Gln可合成嘌呤、嘧啶和氨基酸，增加肠黏膜DNA及蛋白质合成；3）Gln可促进谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成，GSH有抗氧自由基、抗细胞凋亡的作用；4）Gln增强凋亡抑制基因bcl-2的表达［12］；5）Gln可通过多胺途径，与胰岛素样生长因子及表皮生长因子等协同作用，促进黏膜上皮细胞的分裂增殖。　　总之，TPN营养液中添加Gln能够加强对小肠黏膜屏障的保护作用，其作用机制可能与Gln上调IRI小肠黏膜细胞的HO-1表达有关，对Gln的临床应用提供了的理论依据。    【参考文献】　　[1] Zhang W, Frankel WL, Singh A. 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