癫疒间持续状态与神经细胞程序性死亡

癫疒间持续状态与神经细胞程序性死亡作者：王胜军，迟兆富    作者单位：250012济南，山东大学齐鲁医院神经内科 　　癫疒间发作，尤其是癫疒间持续状态（SE）可以造成海马神经细胞死亡，而目前对神经细胞死亡形式及分子机制仍不十分清楚。通常认为神经细胞死亡存在坏死与凋亡两种形式，前者是被动的突发性细胞肿胀与溶解过程，后者则属于主动程序性细胞死亡。近来研究发现SE在急性期可以引起神经细胞内多种与凋亡有关的基因和蛋白的激活，但细胞死亡的形态却类似坏死。人们不禁疑问，神经细胞程序性死亡都包括那些形式？1  神经细胞程序性死亡    程序性死亡是细胞主动决定自身命运的死亡形式，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。通常人们将程序性死亡与凋亡等同为一个概念，其实，二者差别很大，程序性死亡是个功能性的概念，描述生物体中某些细胞死亡是一个预定的并受到严格程序控制的生理或病理过程；而细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述有着一整套形态学特征的与突发性坏死完全不同的细胞死亡形式。近来的研究［1,2］表明，一定条件下细胞可以发生非凋亡性程序性死亡，如自噬性细胞死亡与程序性坏死。目前，一般将细胞死亡分为程序性死亡（包括凋亡与非凋亡性程序性死亡）与被动性死亡。　　1.1  凋亡的一般特征  凋亡是程序性死亡中最经典的类型，凋亡细胞在形态学表现为细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞核染色质浓缩，聚集核膜周围，胞浆中形成凋亡小体，而且胞膜结构完整，细胞周围无炎性反应等。细胞凋亡过程通常涉及到一类能特异性切割靶蛋白天冬氨酸羟基肽键的半胱氨酸蛋白酶（caspase）的激活。经典的凋亡发生信号途径通常有二，（1）内源性途径：起源于线粒体释放细胞色素C，激活caspase9；(2)外源性途径: 细胞膜表面的死亡受体被活化，从而激活caspase8。最近的研究［3］提示细胞内还存在一条源于内质网，继而激活caspase12、caspase9的新凋亡途径。　　1.2  非凋亡性程序性死亡的特征  目前，人们对非凋亡性程序性死亡了解仍很少，争议也很大。自噬性细胞死亡与程序性坏死是研究相对较多的两种形式。　　1.2.1  自噬性死亡  自噬性死亡不同于凋亡，形态学上表现为细胞内自噬体明显增多。经典的凋亡过程常常是早期出现微管结构的破坏，晚期才出现细胞器破坏；而自噬性死亡则与之相反，细胞器在早期就被破坏。另外，自噬性死亡在机制上也与凋亡的caspase依赖性过程有着明显差别。自噬性死亡通常与溶酶体的降解功能有关，在细胞内形成各种细胞器的自噬小泡。N甲基D天冬氨酸(NMDA)可以造成海马脑片CA1、CA3区神经元死亡；超微结构研究发现这些死亡细胞的形态学改变不同于坏死或凋亡，这种死亡可被cjun氨基酸末端活化蛋白激酶（JNK）信号途径介导，阻断（JNK）活性可明显减少死亡细胞［4］。Yu等［5］证实zDEVDfmk诱导成纤维细胞L929的死亡不仅与受体反应蛋白(RIP)有关，同时应用RNA干扰技术发现死亡细胞与自噬性死亡相关的Beclin1及Atg7蛋白的关系也很密切。自噬性死亡与凋亡的信号途径还存在着交叉联系。在凋亡外源性途径中起着重要作用的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）、肿瘤坏死因子（TNF）等死亡受体分子也参与诱导自噬性死亡，而拮抗凋亡的磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶体蛋白（PI3K/Akt/TOR）信号途径也表现出抑制自噬性死亡的功能［6,7］。此外，Bcl2家族蛋白也可以通过非caspase依赖的途径调节自噬性死亡。　　1.2.2  程序性坏死  经典的坏死表现为细胞浆空泡化，细胞膜破裂，细胞内容物溢出，细胞周围炎性反应等。程序性坏死意味着细胞坏死是经过信号途径有规律发生的过程。细胞非caspase依赖的程序性死亡常具有坏死细胞的形态，在细胞受到Fas﹑TRAIL等死亡受体刺激，或caspase活性被zVADfmk阻断后，死亡细胞仍会表达坏死标记物,出现坏死形态，这种形式的细胞死亡在应用抗氧化剂后明显减少［2］。研究［8］还提示，细胞凋亡能阻止这种程序性坏死的发生，这很可能是既往的研究中很少观察到这一程序性坏死的原因。Degterev等［9］发现一种化学小分子Necrostatin1能够抑制Fas/TNFR引起的坏死。该分子能专一性地阻断神经细胞坏死，但对caspase依赖性的凋亡没有抑制作用;研究进一步证实了坏死不都是非程序性的，也能由细胞信号途径介导。以前，很多和坏死形态相似的死亡被误认为是坏死，因此有必要把传统意义的坏死分为两类，即坏死和程序性坏死［10］。2  SE导致神经细胞死亡的机制    SE会导致神经细胞程序性死亡的现象已被广泛认可，但这种程序性死亡的类型与机制仍困惑着人们，目前SE与caspase蛋白酶的关系都存在很大争议。　　2.1  SE与caspase依赖性程序性死亡  Caspase蛋白家族在细胞凋亡过程中扮演着重要角色，被认为是凋亡的执行者。它以有序的方式对细胞进行“破坏”，通过切断细胞与周围的联系，拆散细胞骨架，阻断细胞DNA复制和修复，损伤DNA与核结构，从而使细胞降解为凋亡小体。Caspase3被认为是细胞凋亡过程中最重要的执行分子，可以被内源性caspase9及外源性caspase8激活。SE发生后，应用caspase蛋白酶抑制剂zDEVDfmk可以减少神经细胞的死亡。　　研究发现caspase3与SE造成的早期神经死亡关系不大，Narkilahti等［11］应用免疫组化技术与Western  Blot方法在SE发生后6～24 h未发现caspase3激活，即使在SE 24 h后细胞出现DNA梯带后仍未观察到caspase3的变化;而在SE发生7 d后则检测到胶质细胞caspase3活性明显增高。最近的研究［12］发现匹罗卡品致大鼠SE后3 d内仅杏仁核﹑梨状皮质神经元表现出caspase3阳性的凋亡现象；7 d后海马神经元也出现caspase3激活、TUNEL染色阳性的凋亡细胞，提示caspase3依赖性凋亡在SE造成的迟发性细胞死亡中发挥着一定的作用。　　2.2  SE与非caspase依赖性程序性死亡  Caspase在细胞凋亡过程中的作用处于中心地位。细胞凋亡产生的DNA梯带与脱氧核糖核苷酸酶(CAD)的活化有关。在正常细胞中，CAD与抑制分子(ICAD)结合形成异源性二聚体，当ICAD被caspase3切割后，CAD从二聚体中释放，表现出活性，能将DNA切断成约180 bp的片段，形成DNA梯带。海藻氨酸诱发大鼠SE发生1 d后，DNA梯带就能被检测到［11］;SE发生2 d后在海马与嗅皮质神经元可发现ICAD与CAD分离现象。最近，Takano等［13］采用海马内注射海藻氨酸的方法，并未发现24 h内海马神经元出现CAD激活，且caspase3也未活化，这提示很可能存在其他剪切ICAD酶或造成DNA梯带的DNA酶，凋亡诱导因子 (AIF)就很可能参与这一过程。AIF是定位于线粒体膜间隙中的一种氧化还原酶，在死亡信号或细胞胁迫的刺激下，线粒体通透性转变孔开放，AIF可移位进入细胞核内，引起染色质凝集和DNA梯带的产生［14,15］。    对非caspase依赖性的程序性死亡的研究发现，这种细胞死亡类型在神经系统通常由NMDA受体介导，线粒体蛋白AIF和核酸内切酶G在这一过程中发挥重要作用。被谷氨酸NMDA和海藻氨酸受体激活的AIF，可以通过Bax依赖或非Bax依赖等机制造成神经细胞死亡［15］。    对体外皮质神经元培养的实验［16］也发现，由NMDA受体激活而造成的神经细胞死亡与AIF密切关联，而与细胞色素C从线粒体的释放及caspase3的激活关系不大。Takano等［13］还发现，海藻氨酸诱发SE后，钙蛋白酶可以激活Bcl2家族中的Bid蛋白，Bid的活性片段转移到线粒体，促进AIF释放和核酸内切酶G的激活，前者可将DNA切割成约50 kb的片断，而后者则产生180 bp的核酸碎片，最终造成细胞核固缩与碎裂。　　2.3  SE与程序性坏死  Fujikawa等［17,18］研究发现，匹罗卡品诱导大鼠SE后3 d内海马区并无caspase3的激活，光镜和电镜研究显示损伤神经元大多表现为坏死形态，且这些坏死神经元亦表现出DNA 梯带和TUNEL染色阳性。Niquet等［19,20］在神经元培养过程中也发现，Caspase3免疫反应阳性的神经元在形态上表现为坏死。应用caspase3的抑制剂DEVDfmk后，神经元坏死的程度明显减轻。这些都提示SE造成的急性神经元坏死并非一个简单的被动性坏死，很可能也是一个程序性的主动过程。目前对这一现象的分子机制仍了解不多。　　总之，SE诱发的神经元死亡在形态学上类似坏死，整个死亡过程也存在复杂的信号蛋白参与调节。目前，在癫疒间损伤过程中caspase家族蛋白的作用仍有争议，而非caspase依赖的细胞程序性死亡的作用日渐被重视，比如，NMDA受体介导的钙蛋白酶Ⅰ活化可以造成AIF与核酸内切酶G的激活，最终导致细胞核固缩，DNA梯带形成，形态上最终表现为凋亡样或坏死样死亡。目前，神经保护药物NMDA受体阻断剂在应用中存在很大毒性及不良反应，将来，拮抗不同死亡途径的多种药物联合应用，很可能会更有利于SE的治疗。【参考文献】　　［1］Sperandio S, DeBelle I, Bredesen DE. 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