ERΔE5在乳腺癌组织中的表达及临床意义探讨

ERΔE5在乳腺癌组织中的表达及临床意义探讨作者：华彬　李波　陆旭　肖文政　韦军民    作者单位：北京医院　普外科　     【摘要】  目的：通过检测乳腺癌和癌旁乳腺组织（乳腺癌标本边缘外5 cm）中雌激素受体α（Estrogen Receptor ，ERα）剪切变异体ERΔE5表达水平的差异，探讨ERΔE5在乳腺癌组织中的表达及临床意义。方法：培养乳腺癌细胞株ZR-75-1，采用RT-PCR检测目的基因ERΔE5，建立阳性对照体系。以液氮冷冻储存的59例乳腺癌组织和59例癌旁乳腺组织提取目的基因，进行对照实验，检测ERΔE5在乳腺癌组织和癌旁乳腺组织中的表达状况，分析二者的表达差异及其临床意义。结果：在ER阳性乳腺癌标本中，ERΔE5阳性20例（20/44），ER阴性的乳腺癌标本中，ERΔE5阳性6例（6/15），两者差异无统计学意义（P=0.7170）； 在人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor，HER-2）阳性的乳腺癌标本中， ERΔE5阳性20例（20/22）, HER-2阴性的乳腺癌标本中，ERΔE5阳性6例（6/37）。采用单因素分析，发现乳腺癌标本中ERΔE5的阳性表达与HER-2的阳性表达呈正相关（P<0.0001）。在乳腺癌标本中ERΔE5的阳性表达率为44.07%(26/59)；在癌旁乳腺组织中未见ERΔE5的表达，两者比较差异有统计学意义（P<0.0001）。在乳腺癌标本中ERΔE5的表达与临床分期无相关性（P=0.9084）。结论：在乳腺癌标本中ERΔE5的表达显著高于癌旁乳腺组织，而且与HER-2表达呈正相关，提示ERΔE5可能是一种新的临床预后的指标。     【关键词】  乳腺肿瘤·受体，雌激素·ERΔE5·人表皮生长因子受体     Expression of ERΔE5 in breast cancer and its clinical significance HUA Bin, LI Bo, LU Xu, XIAO Wen-zheng， WEI Jun-min   Department of General Surgery , Beijing Hospital(Beijing 100730,China)    【ABSTRACT】 Objective： To evaluate the potential relationship between ERΔE5 and the pathophysiologic markers of breast carcinoma by detecting the expression of estrogen receptorα(ERα) splicing variant ERΔE5 in the carcinomatous specimen and its paracarcinomatous breast tissue. Methods：The expression of ERΔE5 in breast carcinomatous tissue and its paracarcinomatous breast tissue in 59 patients of breast cancer was detected respectively by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The RT-PCR amplification of ERΔE5 of breast cancer cell line 　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,内分泌治疗作为综合治疗的重要组成部分已愈来愈受到重视。1986年发现了第一个雌激素受体（Estrogen Receptor ，ERα），随着对其功能认识的深入，业已将乳腺癌分为两大类：激素依赖型和激素非依赖型［１］。目前认为在乳腺癌发生的早期，肿瘤细胞表现为激素依赖性生长，因而可以使用激素拮抗剂进行治疗,但肿瘤细胞会逐渐演变为激素非依赖性生长，产生这种变化的分子机制目前仍不清楚。随着RT-PCR技术和RNA酶抑制剂的使用, 1991年前后已在mRNA水平发现了20余种ER的剪切变异体,被认为是乳腺癌激素非依赖性生长的一个可能因素［２］。在这些剪切变异体中，ERΔE5是少数几种功能域阳性的变异体之一。本研究旨在通过检测乳腺癌组织和癌旁乳腺组织中ERα剪切变异体ERΔE5的表达，探讨ERΔE5在乳腺癌临床诊治中的意义。1　资料与方法    1.1　一般资料　收集我科乳腺中心2004年4—10月间收治的乳腺癌患者59例，均为女性，年龄31～78岁，平均年龄53岁。均行乳腺癌切除术，以乳腺癌组织为实验组，取肿瘤边缘外5 cm的癌旁乳腺组织作为对照组。所有标本均经病理科医师确诊后，立即存放于液氮中冷冻储存（自取材到冷冻储存的时间控制在30 min内），直至实验中开始使用。59例乳腺癌标本中ER阳性44例，ER阴性15例， HER-2阳性22例，HER-2阴性37例；临床分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期26例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例，未分期3例；病理类型包括浸润性小叶癌1例，黏液癌2例，导管原位癌2例，混合癌10例（其中浸润性导管癌并浸润性小叶癌6例，浸润性导管癌并黏液癌4例），浸润性导管癌44例。    1.2　主要试剂与仪器　人乳腺导管上皮癌细胞株ZR-75-1购自中国医学科学院基础所；RT-PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成； SuperScriptⅡTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR购自Invitrogen公司；Taq酶、RNA提取剂（Trizol）购自Promega公司；RPMI 1640购自GIBCO公司。主要仪器包括倒置显微镜（OLYMPUS,日本）、酶标仪（Bio-Rad，日本）、紫外分光光度仪（Pharmacia Biotech，英国）、台式高速离心机（HERAEUS,德国）、凝胶成像分析仪（Bio-Rad，日本）、恒温恒流电泳仪（北京东方仪器厂）、水浴摇床（EYELA,日本）、CO2培养箱（NAPCO，法国）等。    1.3　实验方法    1.3.1　细胞培养　以RPMI 1640液为培养基（含2  mmol/L谷氨酰胺，10%FBS，100 U/mL青霉素钠，100 U/mL链霉素），于37℃、5%CO2培养箱中培养ZR-75-1细胞株。当细胞铺满瓶时弃去细胞培养液，经适当的处理后采用Promega公司的RNA提取液Trizol提取细胞总RNA。    1.3.2　检测RNA质量　取细胞总RNA样品30 μg，经适当处置后于65℃变性15 min，同时制备1%的琼脂糖甲醛变性凝胶（含1×MOPS，2.2 mmol/L的甲醛），预电泳5 min，以1×MOPS为电泳缓冲液，加样后以3～5 V/cm恒压电泳，检测RNA的质量（图1）。    1.3.3　RT反应　将提取的总RNA 5 μg在总体积为20 μL的反应体系中，用SuperScriptⅡ RT进行逆转录反应。65℃ 变性5 min，4℃冷却 3 min，42℃加入逆转录酶后反应 52 min，72℃灭活逆转录酶15  min，4℃保存。    1.3.4　PCR　ERΔE5上游引物：5’TGC CCT ACT ACC TGG AGA ACG 3’，下游引物：5’ATT TTC CCT GGT TCC TGG CAC 3’；内参ＧＡＰＤＨ上游引物：5’AAG GCT GAG AAC GGG AAG CTT GTC ATC AAT 3’，下游引物：5’TTC CCG TCT AGC TCA GGG ATG ACC TTG CCC 3’。PCR总体积为50 μL，RT反应产物为8 μL，内参基因GAPDH的PCR反应温度及时间设定如下：94℃变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸 90 s，共30个循环；然后72℃延长7 min，4℃保存。目的基因ERΔE5的PCR温度及时间设定如下：94℃变性5 min；94℃ 变性30 s，65℃退火90 s，72℃延伸2 min共40个循环；然后72℃延长15 min，4℃保存。    1.3.5　PCR的反应产物电泳及基因测序　PCR的反应产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳（GAPDH）和2%琼脂糖凝胶电泳（ERΔE5）检测特异基因条带，于凝胶成像分析系统中进行拍照，检测目的基因是否表达。PCR反应产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，送上海俊科生物技术有限公司测序，将测序的结果与已知的人ERΔE5序列做Blast分析。以上细胞反应的过程作为实验体系的阳性对照。    1.4　乳腺标本目的基因检测　乳腺癌标本及癌旁对照标本在液氮冷冻状态下研磨后，将组织粉末放入无RNA酶的离心管中，按50 μg组织1 mＬ Trizol将研磨后的组织和Trizol混合并用匀浆机制备匀浆。余实验步骤同细胞实验部分。    1.5　统计学分析　用STATA version 8.0 统计软件进行数据处理。每组数据均采用χ2检验，可信区间（CI）为95%，P≤0.05为差异有统计学意义。2　结果    本研究所有标本提取的RNA经过1%的琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测合格后进行目的基因的检测。ZR-75-1细胞株及部分乳腺癌组织中检测到含有730 bp的目的基因ERΔE5，含500 bp的内参基因GAPDH均阳性表达（图２）    在ER阳性乳腺癌标本中ERΔE5阳性率为４５.５％（20/44），ER阴性的乳腺癌标本中ERΔE5阳性率为40.0％（6/15），两者差异无统计学意义（P=0.7170）； HER-2阳性的乳腺癌标本中， ERΔE5阳性率为90.9%（20/22），HER-2阴性的乳腺癌标本中 ERΔE5阳性率为16.2%（6/37）；采用单因素分析，乳腺癌标本中ERΔE5的阳性表达与HER-2的阳性表达成正相关(P＜0.0001，表1)。在乳腺癌标本中ERΔE5的阳性表达率为44.07%(26/59)，在癌旁乳腺组织中未见ERΔE5的表达，两者差异有统计学意义(P＜0.0001)。在3例未分期乳腺癌标本中，ERΔE5阳性2例；在19例Ⅰ期乳腺癌标本中，ERΔE5阳性8例；在26例Ⅱ期乳腺癌标本中，ERΔE5阳性12例；在10例Ⅲ期乳腺癌标本中，ERΔE5阳性3例； 1例Ⅳ期乳腺癌标本阳性表达ERΔE5，临床分期与ERΔE5的表达无统计学意义（P=0.9048）。3　讨论     １９８６年ERα基因首次被发现［3］，其功能和临床意义受到医学界的关注。目前发现约60%的乳腺癌患者ERα阳性。诸多临床研究结果显示，ERα是乳腺癌独立的预后因素，而且可以用来指导内分泌治疗［4］。1991年前后人们相继发现了数十种ERα剪切变异体,但是这些变异体在乳腺肿瘤的发生、发展过程中所起的作用及其与乳腺癌预后的关系尚不明确［5-6］。有研究表明，ERΔE5在癌旁乳腺组织及肿瘤组织中均有表达，但在癌旁组织中表达量显著低于肿瘤组织［7］。但本研究只发现肿瘤组织中４４.１％（26/59）表达730 bp的ERΔE5，而癌旁组织中则没有表达。Indra等［8］研究发现不同人种中ERΔE5的表达状况亦不同，如在高加索白人女性正常乳腺组织和肿瘤组织中都不曾发现ERΔE5的表达；而在非裔黑人美国女性的肿瘤组织和正常乳腺组织中均可以发现3种ERΔE5，分别为730 bp、540 bp和420 bp。因此推测，研究结果可能与人种有关，尚需大样本临床研究验证。    ERΔE5已发现十余年，是一种功能域阳性的ERα剪切变异体，体外实验中发现ERΔE5可以发生二聚化，在不依赖雌激素的情况下激活目的基因［9-10］，因而有学者认为它可能在乳腺癌由激素依赖型向激素非依赖型转换过程中发挥了重要作用［11］。虽然ERΔE5无配体结合区，但它仍具备激活转录的功能，通过与ERα竞争SRC-1e抑制ERα对基因转录的调节［12-13］。此外，Ｍａｄｓｅｎ等［１４］发现在ER阳性的乳腺癌细胞系中转染ERΔE5后细胞对他莫昔芬耐药。本研究证实在乳腺癌组织中ERΔE5的表达显著增加，这种变化可能通过不同途径改变雌激素对乳腺组织的调控，进而改变乳腺癌患者对雌激素受体拮抗剂和其他治疗的反应。    关于ERΔE5与乳腺癌预后关系的研究报道较少，Indra等［8］研究发现非裔美国女性与高加索白人女性乳腺癌患者相比预后差，基因水平检测发现非裔黑人美国女性乳腺癌患者中ERΔE5的表达显著高于高加索白人女性乳腺癌患者，因而考虑ERΔE5的异常表达可能与两类患者预后不同有相关性。本研究未发现目的基因的表达与临床分期有相关性，但经单因素分析发现，ERΔE5的表达与HER-2的表达呈显著正相关（P＜0.0001）。2000年，ASCO发表了新的乳腺癌、结直肠癌肿瘤标记物使用纲要，文中明确指出，HER-2为乳腺癌的肿瘤标记物之一［6］。目前认为，乳腺癌组织中HER-2的阳性表达与肿瘤分化差、淋巴结阳性呈正相关［15］；HER-2阳性的乳腺癌患者对他莫昔芬治疗的反应差。本研究发现HER-2的表达与目的基因的表达显著相关，提示ERΔE5可能是一种可以预测乳腺癌预后和选择内分泌治疗的新指标。【参考文献】[1] Clarke R, Lippman ME. 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