磷酸二酯酶4D基因多态性与缺血性脑血管病的关系

作者：徐淑兰   

作者单位：210029南京医科大学附属脑科医院神经内科

【摘要】  探讨中国汉族人群磷酸二酯酶4D (PDE4D) 基因多态性与缺血性脑血管病(ICVD)的关系。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法检测116例ICVD患者和110名正常对照者PDE4D基因SNP45、SNP83和rs918592位点的多态性及其与糖代谢指标的关系。结果 PDE4D基因rs918592的A等位基因频率ICVD组(58.6%)、腔隙性脑梗死亚组(63.8%)较正常对照组(48.6%)明显增高(均Ｐ<0.05)；rs918592、SNP83基因型及等位基因频率各组间差异无统计学意义(均Ｐ>0.05)；SNP45位点未见多态性。糖代谢指标在不同的SNP83、rs918592 基因型间差异无统计学意义(均Ｐ>0.05)。结论 中国汉族人群PDE4D基因rs918592位点上A等位基因可能是ICVD的危险因素之一； PDE4D基因可能不是通过糖代谢影响ICVD的发生。

【关键词】  磷酸二酯酶4D基因 单核苷酸多态性 缺血性脑血管病

    Relationship between  phosphodiesterase 4D  gene polymorphism and ischemic cerebral vascular disease  XU Shulan, ZHANG Yingdong, LIN Xingjian. Department of Neurology,  Brain Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

    Abstract：Objective  To investigate the relationship between phosphodiesterase 4D (PDE4D)  gene polymorphism and ischemic cerebral vascular disease( ICVD)  in the Han people in China. Methods  The singlenucleotide polymorphism in SNP45，SNP83 and rs918592 of PDE4D gene were determined by PCRRFLP and the relationship between the them and glycometabolic indeces were analysed in 116 cases（ ICVD group） and 110 normal controls (NC group). Results  The rate of Aallele in rs918592 was significantly higher in  ICVD group (58.6%) and the subgroup of lacunar infarction (63.8%) than that in the NC group (48.6%) (allP<0.05). Neither the rates of its genotypes nor the genotypes or alleles in SNP83 were significantly different in   ICVD and NC groups(all Ｐ>0.05) No basevariation in SNP45 was found in this study. There was not significantly different of glycometabolic indeces in different genetypes of both SNP83 and rs918592(all Ｐ>0.05) . Conclusions  The Aallele in rs918592 may one of the risk factors in  development of ICVD in the Han people in China. PDE4D gene may be not included glycometabolic mechanism to effect ICVD.

    Key words：phosphodiesterase 4D gene；singlenucleotide polymorphism；ischemic cerebral vascular disease

     2003年Gretarsdottir等［1］发现磷酸二酯酶4D（PDE4D）基因变异与冰岛人群的缺血性脑血管病(ICVD)相关；认为该基因是第一个真正意义上的卒中易患基因。此后的许多研究结果并不一致。本研究对国人ICVD患者PDE4D基因的SNP45、SNP83和rs918592位点进行多态性分析，同时分析其与糖代谢的关系，探讨该基因多态性与国人ICVD的关系。

    1  对象与方法

    1.1  对象  （1）ICVD组：116例，系2006年12月～2007年4月在本院神经内科住院的患者，男70例，女46例；年龄32～91岁，平均(65.9±12.4)岁；符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经头颅CT/MRI证实。排除脑栓塞和既往有脑出血、抑郁症者。按TOAST分型标准［2］分为大动脉粥样硬化性卒中(LA)87例和小动脉闭塞性卒中或腔隙型梗死(SA)29例。（2）正常对照组：110人，男60人，女50人；年龄30～85岁，平均(65.1±12.7)岁。为同期本院健康体检者，否认心、肺、脑疾病和严重的炎症。两组性别和年龄均具有可比性。

  1.2  方法

    1.2.1  样本采集  取入组者晨空腹静脉血5 ml，其中2 ml检测血糖；3 ml EDTA抗凝后，即刻离心取血浆置-20℃保存待测胰岛素浓度，剩余血细胞经常规蛋白酶K氯仿法提取DNA。

    1.2.2  PDE4D基因多态性分析  采用聚合酶链限制性片段长度多态性分析法（PCRRFLP）扩增PDE4D基因的目的片段。引物序列分别为：SNP45上游引物：5′TGGCTGCAGATTACAGTG3′,下游引物：5′AGGAGCAGGTTAAAGCAG3′； SNP83上游引物:5′GATTTATGTCTTA TACTTTC3′,下游引物：5′TGCTTTTTGAAGATGCATACTTTGT3′；rs918592上游引物：5′CAGAGTGCTGATCAACATTGGT3′,下游引物：5′ATGGAGTCCACAGGGCTTTATT 3′；均由上海英迅公司合成。采用PE 2400型PCR扩增仪（美国Perkin Elmer公司）进行热循环扩增。25 μl反应体系中含有：2.0 mmol/L MgCl2、1×Thermo philic DNA聚合酶Buffer、SNP45、SNP83和rs918592引物各10 μmol/L、250 μmol/L dNTPs、1.0 U TaqDNA聚合酶和约150 ng模板基因组DNA。PCR循环条件均为94℃变性5 min；94℃ 30 s，SNP45、SNP83和rs918592的退火温度分别为58℃、53℃和59℃，30 s，35个循环后，72℃ 延伸10 min。扩增的PCR片段长度分别为225 bp、368 bp和536 bp。如SNP45、SNP83和rs918592位点上分别为G、C、G碱基则可被相应的限制性内切酶TaaI、TaiI和 ApaLI酶切成大小分别为60/165 bp、152/216 bp和148/388 bp的两个片段。SNP45、SNP83的酶切体系为：PCR产物10 μl,10×buffer R 2 μl , TaaI/TaiI (Promega公司)10 U，去离子水18 μl ,65℃水浴过夜。rs918592的酶切体系： PCR产物10 μl，10×缓冲液2 μl，ApaLI(NEB公司)10 U，加去离子水至体积20 μl，于37℃水浴酶解过夜。取酶切产物8 μl于2%琼脂糖凝胶，溴化乙啶染色后在荧光灯下观察结果并拍照。

    1.2.3  血糖及胰岛素水平检测  采用葡萄糖氧化酶法测定血糖水平;采用放免法测定胰岛素浓度，操作步骤按试剂盒说明书进行（试剂盒购于北京科美东雅生物技术有限公司）。采用Katz等［3］提出的胰岛素敏感指标（QUICKI）计算公式｛1/［log 空腹血胰岛素(mU/L)+log 空腹血糖(mg/dl)］｝评价胰岛素抵抗。

    1.2.4  单倍体分析  一条染色体上若干个点的等位基因的组合称为1个单倍体型。SNP45、SNP83和rs9185923个位点均位于PDE4D7的启动子附近，3者相互毗邻，故对这3个多态性位点在入组者的基因型利用以贝叶斯算法（Bayesian algorithm）为基础的PHASE软件（PHASE 2.1软件）进行逐个个体单倍体的构建。

    1.2.5  统计学方法  采用SPSS 13.0软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差(±s)表示，两均数的比较采用非配对t检验，多组均数的比较采用方差分析。计数资料采用χ2检验。用HW平衡来检验各位点的群体代表性。

    2  结  果

    2.1  各组SNP83位点基因型及等位基因频率的比较  见表1。SNP83位点经PCRRFLP有3种 带型（见图１）,分别为TT、CT和CC基因型。SNP83基因型和等位基因频率在各组间差异无统计学意义。 表1  各组SNP83基因型及等位基因频率的比较

    2.2  各组rs918592位点基因型及等位基因频率的比较  见表2。rs91859位点可见3种带型（见图2）， 表2  各组rs918592基因型及等位基因频率的比较注：与正常对照组比较*P<0.05 分别为AA、GG、AG基因型。各组间基因型频率差异无统计学意义。ICVD组A等位基因频率显著高于正常对照组（χ2=4.528,P=0.033;OR 1.496,95% CI:1.032～2.170）；其中SA组该等位基因频率明显高于正常对照组(χ2=4.223, P=0.040; OR=1.861, 95%CI: 1.024～3.381);LA组与正常对照组间差异无统计学意义。

 2.3  各组SNP45基因型及等位基因频率的比较  全部受试者在SNP45位点PCRRFLP分析未见多态性现象，所有的PCR产物均能被酶切为60 bp、165 bp两个片断（见图3）。

    图3  PDE4D基因SNP45位点PCRRFLP电泳图 M：marker; 1：空白对照； 2、3、4：G/G

    2.4  各组单倍体分析结果  见表３。各单倍体型分布在ICVD组和正常对照组间差异无统计学意义（χ2=4.760,P=0.190）。与TG比较仅TA单倍体型在两组之间分布有统计学意义(χ2= 4.145,P=0.042;OR=1.550,95%CI:1.016～2.365）。表3  各组间SNP83、rs918592单倍体分布的比较注：与TG比较 *Ｐ< 0.05

    2.5  各组糖代谢指标的比较  ICVD组空腹血糖、空腹胰岛素浓度和QUICKI分别为(6.39±2.73) mmol/L、(11.48±5.81) mU/L和(0.331±0.028)，正常对照组分别为(5.21±0.93) mmol/Ｌ、(7.11±4.00) mU/L和(0.365±0.033)。ICVD组空腹血糖和空腹胰岛素浓度的水平显著高于正常对照组(均Ｐ<0.001)， QUICKI指数显著低于正常对照组(Ｐ<0.001)。

    2.6  各基因型间糖代谢指标的比较  见表4。入组者不同的SNP83和rs918592基因型糖代谢指标间差异无统计学意义。 表4  不同SNP83、rs918592基因型糖代谢指标比较(±s)基因型  例数空腹血糖

    3  讨  论

    PDE4D基因位于人类染色体5q12上，全长约1.6 Mb，含有22个外显子和21个内含子，其蛋白产物PDE4D是一类能特异性水解环磷酸腺苷（cAMP）且能被咯利普兰(rolipram)特异性抑制的磷酸二酯酶。由于存在不同的启动子及翻译后的选择性剪切作用，该基因的蛋白产物有很多种异构体,迄今为止已发现有9种：PDE4D 1～9。不同的PDE4D异构体在氨基酸组成、三维结构、对cAMP的敏感性、对抑制剂的反应、对cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化调节作用以及在不同细胞内的分布均存在差异［4］，并被认为异构体表达水平的差异可能和PDE4D与ICVD有关［5］。

    对冰岛人群的研究［１］发现，PDE4D基因的SNP45、SNP83多态性和ICVD相关，其中SNP45和ICVD以及LA和心源性ICVD的总和具有显著相关性，该位点上的A等位基因被认为是ICVD的保护性因素，但是这种结果在后来的研究中没有得到证实［6,7］，甚至在有些国家如美国俄亥俄州的白人和黑人［8］、日本人群［9］中发现该位点没有多态性，因而有人对该位点和ICVD的关系提出了质疑［10］。本研究结果显示SNP45位点无多态性，该位点仅存在着G碱基；与李才明等［11］的研究结果一致，表明在汉族人群中该位点可能没有多态性。对SNP83位点的多态性研究［8,12,13］肯定了与ICVD相关性。本组研究未得出SNP83位点多态性与ICVD及其LA和SA亚型相关，与在日本人群的研究［9］结果类似。本研究中该位点的C等位基因在正常对照组中的频率为18.6%，而在日本人群中该等位基因的频率为11.8%，均较白种人群中的52.0%显著降低［1］，可能与种族差异或样本量较小有关。

    rs918592是Song等［13］ 发现的与非裔美国女性和高加索女性的早发性卒中（发病年龄<45岁）相关的一个新的位点，且与LA、SA等ICVD亚型相关，吸烟对该位点变异致病有协同作用。本研究虽然未发现ICVD与正常对照组rs918592基因型分布有显著性差异，但其A等位基因则与ICVD有显著性关联，其OR值>1；进一步对ICVD亚型分析发现A等位基因与SA具有明显关联，可能是SA的危险因素。这和Song等［13］研究结果是部分一致的。但由于两者的OR值均较小，因而不能认为其是ICVD的主要危险因素。

    采用PHASE 2.1建立SNP83和rs918592两位点组成的单倍体后分析可见，受试者中TA单倍体型相对最多见，虽然ICVD患者与正常对照者间各单倍体型分布差异无统计学意义，但ICVD患者中TA单倍体型频率要高于野生的TG单倍体型，似提示TA单倍体型与ICVD的关联性。SNP83和rs918592均位于PDE4D7的启动子附近的内含子区域内，此种单倍体可能会协同影响PDE4D7的表达水平，进而与ICVD相关联，对此也有待进一步研究确定。 近年来，越来越多的研究［14,15］表明，胰岛素抵抗具有致糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等作用，是ICVD的重要危险因素。本研究对PDE4D基因多态性与胰岛素抵抗是否具有致脑血管病的相关性协同作用进行分析，结果仅证实ICVD患者血糖、胰岛素水平增高，QUICKI降低，并未发现PDE4D基因的SNP83、rs918592碱基变异对血糖、胰岛素水平和QUICKI影响的现象，亦支持PDE4D基因多态性与ICVD的关联性并不依赖糖代谢的改变。

  本研究分析了PDE4D与中国汉族人群缺血性脑卒中的关系，发现PDE4D基因rs918592位点上A等位基因可能是ICVD的危险因素之一； PDE4D基因可能不是通过糖代谢影响ICVD的发生。

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