他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及ER表达影响的研究

他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及ER表达影响的研究作者：白文坤　王文奇　时昌文　吴洪文    作者单位：山东大学附属千佛山医院　１超声诊疗科　２消化内科　３普外中心实验室　 4山东省淄博市第一人民医院　消化科　    【摘要】  目的：研究他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）对人肝癌HepG2细胞增殖和HepG2细胞ER表达的影响。方法：按照TAM的浓度不同分为7.5 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L 3组，对照组不加TAM，每孔加入1×105 mL-1细胞0.1mL，培养24、48和72 h，采用MTT法测定抑制率；细胞免疫组化染色观察TAM对肝癌细胞ER的表达的影响。结果：TAM抑制人肝癌细胞增殖及ER表达，并具有时间-浓度依赖。结论：TAM可能通过影响肝癌细胞ER的表达抑制肝癌细胞增殖。    【关键词】  肝肿瘤·细胞增殖·他莫昔芬·受体，雌激素    Effects of tamoxifen on proliferation and ER expression of  human hepatocellular carcinoma cells BAI Wen-kun1,WANG Wen-qi2,SHI Chang-wen3,WU Hong-wen4    Ultrasound Diagnosis Department, 2Department of Gastroenterology,3Central Laboratory of General Surgery, Qian Foshan Hospital of Shangdong University (Jinan 250014, China)    4Department of Gastroenterology, The People's First Hospital of Zibo, Shandong Province (Zibo 255200, China)    【ABSTRACT】 Objective:To study the effects of tamoxifen on proliferation and ER expression of  human hepatocellular carcinoma cells. Methods: HepG2 cells were treated with tamoxifen at different concentration and different action time. MTT was used to determine the suppression rate of 　　他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)是一种非甾体类抗雌激素药物，应用于肝癌治疗具有一定疗效［1］，但作用机制尚未阐明。本研究通过检测人肝癌HepG2细胞在TAM作用前后增殖活性变化及雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性表达的变化，探讨TAM在肝癌治疗中的作用机制。1　材料与方法    1.1　实验材料　人肝癌细胞HepG2（山东省普外学科重点实验室提供）；即用型鼠抗人ER单克隆抗体（美国Sigma公司）。    1.2　细胞培养　将人肝癌HepG2细胞株常规培养于RPMI 1640培养液中（内加10%小牛血清），培养液中加入青霉素（浓度100 U/mL）和链霉素（浓度100 μg/mL）,37 ℃、5% CO2培养箱中培养。    1.3　分组　按照TAM的浓度不同分为7.5、15、30 μmol/L及0 μmol/L（对照组）4组，每组设6个平行孔。    1.4　MTT实验　取对数生长期HepG2细胞，用RPMI 1640培养液调整细胞数为1×105 mL-1，加入96孔培养板，每孔0.1 mL，37℃、5% CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁约70%~80%时，弃去细胞培养液，分别加入不同浓度的TAM 0.1 mL，培养20、44 和68 h，每孔加入MTT 10 μL，继续培养4 h，将培养液弃去，加入DMSO 150 μL/孔，振荡10～15 min，在492 nm处测定OD值，计算抑制率：    抑制率（%）＝ （1-实验孔OD/对照孔OD）×100%    1.5　ER免疫组织化学染色　将对数生长期的细胞传代后置于6孔板中培养，培养液中分别加入不同浓度的TAM，培养20、44、68 h，放入载玻片，再培养4 h，置载玻片于4℃甲醇和丙酮混合液（1:1）中20 min，使细胞固定，PBS液清洗3×3 min，清洗3次，甩去PBS液，每张载玻片加入50 μL的非免疫性动物血清封闭，置37℃温箱中孵育30 min。采用SP法进行免疫组织化学染色。分别在每张载玻片加入50 μL即用型鼠抗人雌激素受体单克隆抗体即第一抗体，4℃过夜；加入50 μL生物素标记的第二抗体，37℃孵育1 h后加入50 μL链亲和素-过氧化物酶溶液即第三抗体，37℃孵育40 min；加入100 μL新鲜配制的DAB显色剂显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分色，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。    1.6　结果判定　ER阳性结果为细胞核棕黄色着色。高倍镜（×400）下计数500个细胞中染色阳性细胞数，计算ER平均阳性表达率。    1.7　统计学处理　采用SPSS13.0统计学软件进行方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。2　结果    ２.1　TAM作用后对肝癌细胞的影响　TAM对人肝癌细胞抑制率的影响呈明显时间-浓度依赖 （F时间=140.234, P=0.000；F浓度=44.031，P=0.002），时间的影响更明显。随着TAM作用时间延长，TAM对HepG2细胞的抑制作用逐渐加强，24、48和72 h组之间相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）；不同浓度TAM组人肝癌细胞抑制率较对照组均明显增高（均P＜0.05），30 μmol/L组72 h抑制率最高，见表1。    2．2　TAM对人肝癌细胞ER阳性表达的影响　TAM对ER阳性率的影响呈明显时间－浓度依赖 （F时间=70.040, P=0.001；F浓度=27.992，P=0.004），时间的影响更明显。24 、48和72 h 组ER阳性率下降，且差异有统计学意义（均P＜0.05）；不同浓度TAM对HepG2细胞ER的阳性率均有抑制作用, 人肝癌细胞ER的阳性率均较对照组明显降低（均P＜0.05），其中30 μmol/L组72 h ER阳性率最低，见表2。　3　讨论      雌激素长期刺激可导致肝肿瘤发病率升高［2］。肝细胞表达高亲和力的ER，肝癌细胞ER的表达较正常肝细胞增加，雌激素通过ER介导的信号通路来诱导基因转录，从而诱导肝癌的发生［3］。另外，雌激素还可激活蛋白激酶C来促进肝癌细胞的增殖［4］。    TAM是一种非甾体抗雌激素药物，其结构与雌激素相似,在靶器官内竞争ER,减少细胞质内ER的含量,阻止核内雌激素生成基因的转录和ER再合成。在组织培养中可见ER阳性细胞的生长可直接被TAM所抑制。TAM还通过作用于信号转导过程的MAPK通路、阻断蛋白激酶C介导的ERK激活、激活TGF-β来抑制肿瘤细胞的生长［5-6］。    应用TAM治疗肝癌取得了一定疗效，体外实验发现TAM可以抑制肝癌细胞的增殖，具有时间－浓度依赖性［7-8］。但TAM对肝癌细胞ER表达影响的文献报道很少。本研究通过MTT法发现，TAM能明显抑制人肝癌细胞的生长，并且呈时间－浓度依赖。随着TAM作用时间延长，其对HepG2细胞的抑制作用不断加强，72 h组抑制作用最强；随着TAM浓度增加，其对人肝癌细胞抑制率亦明显增加。TAM对ER阳性率的影响呈明显时间－浓度依赖，随作用时间延长， ER阳性率下降；TAM浓度增加，HepG2细胞ER阳性率亦明显降低，以30 μmol/L组72 h ER阳性率最低。提示TAM能抑制肝癌细胞生长，TAM通过与雌激素竞争性结合受体抑制雌激素的信号传导来抑制肿瘤细胞增殖，TAM还可能通过阻断蛋白激酶C，进而减少细胞端粒酶活性、上调p27表达、影响Ca2+通路等促进肝癌细胞的凋亡，抑制肝癌细胞的增殖，但详细的机制有待于进一步研究［9-11］。    TAM可以抑制肝癌细胞的增值，且影响肝癌细胞ER的表达，呈时间－浓度依赖，说明TAM可以通过影响肝癌细胞ER的表达抑制肝癌细胞，为应用TAM治疗肝癌提供理论基础。【参考文献】[1] Lu YS, Hsu C, Li CC, et al. 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