共刺激分子CD28:CTLA4/B7在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用

共刺激分子CD28:CTLA4/B7在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用作者：吴怀国    作者单位：230011 合肥， 安徽省立友谊医院神经内科    【摘要】  目的 研究共刺激分子CD28:CTLA4/B7在实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG） 发病中的作用。方法 将雌性Lewis鼠随机分为EAMG组和对照组；EAMG组采用人工合成的Rα97-116肽段3 次法免疫Lewis鼠，对照组同期注入等量的PBS；3次免疫接种后采用流式细胞术检测CD28、B7-2、 B7-1、CTLA4在外周血、淋巴细胞、单核细胞中的表达。结果 EAMG组大鼠成模率75%；与对照组比较，外周血CD28、B7-2 B7-1、CTLA4的表达明显增加（Ｐ<0.05～0.01）； EAMG组大鼠外周血 CD28、CTLA4主要在淋巴细胞表达及B7-1、 B7-2在淋巴细胞、单核细胞表达显著增加（Ｐ<0.05～0.01） 。结论 EAMG大鼠存在共刺激分子CD28:CTLA4/B7表达异常，共刺激分子CD28:CTLA4/B7可能参与了EAMG的发生、发展。    【关键词】  重症肌无力 共刺激分子 CD28:CTLA4/B7    Role of CD28:CTLA4/B7 costimulatory molecules in experimental autoimmune myasthenia gravis 　　WU Huai-guo,  PENG Xiao-jiang,  LI Jun, et al. 　　Department of Neurology, Anhui Provincial Friendship Hospital, Hefei  230011, China    Abstract：Objective  To study pathogenesis role of CD28:CTLA4/B7 costimulatory molecules in experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG）. Methods  Female lewis rats were divided into EAMG group and control group. The rats were immunized thrice with Rα97-116 peptide in EAMG group, or only with phosphate buffer saline（PBS） in control group. 5 d after the third immunization, the expressions of CD28,CTLA4,B7-1, B7-2 on the surface of  peripheral blood cells, lymphocytes and monocytes were exaimed by flow cytometry. Results  In EAMG group，the achievement ratio of EAMG model was 75%； the expressions of CD28,CTLA4,B7-1, B7-2 on the surface of  peripheral blood cells were significantly  increased than those in control group （P＜0.05～0.01）； the expressions of CD28,CTLA4 were mainly of lymphocytes，the expressions of B7-1, B7-2 were increased in lymphocytes and monocytes（P＜0.05～0.01）. Conclusions  The expressions of CD28:CTLA4/B7 costimulatory molecules are abnormal in the rats with EAMG, which may participate in the occurrence and development of EAMG.    Key words：myasthenia gravis；costimulatory molecules；CD28:CTLA4/B7    重症肌无力（MG）主要由乙酰胆碱受体抗体（AChR-Ab）介导、细胞免疫依赖和补体参与的自身免疫性疾病；实验性自身免疫性MG （EAMG）是广泛采用的MG动物模型［1］。对MG和EAMG的研究［2，3］发现，共刺激分子CD28:CTLA4/B7表达异常在MG发病机制中起关键作用。为了进一步探讨CD28:CTLA4/B7与MG发病的关系，本研究通过鼠源α亚基97-116 （Rα97-116）诱导制备EAMG大鼠模型，观察外周血CD28:CTLA4/B7表达水平及其在MG发病中的作用。1  材料与方法　　1.1  材料　　1.1.1  实验动物 　　6～8周龄的雌性近交系Lewis鼠20只（北京维通利华实验动物技术有限公司），质量（149±5.8）g，在安徽省实验动物中心无特殊病原体动物（SPF）级环境下饲养。随机分为EAMG组（12只）和对照组（8只）。　　1.1.2  主要材料 　　FITC-CD28单克隆抗体（Biole-gend公司）；PE-CTLA4、FITC-B7-2、PE-B7-1单克隆抗体（Ebioscience公司）；弗氏佐剂、辣根过氧化物酶标记小鼠抗大鼠IgG及小牛血清（Sigma公司）；流式细胞仪（EPLCS XL-MCL型，Beckman-Coulter公司）。　　1.2  方法　　1.2.1  免疫原合成 　　Rα97-116序列肽段由西安联美生物技术有限公司在431A型多肽合成仪上固相合成，通过反向高效液相色谱仪（HPLC）纯化至98％纯度，经质谱仪确定其相对分子质量为2252。　　1.2.2  EAMG模型制作 　　参照文献［4］，将与完全弗氏佐剂充分混匀后的含Rα97-116 50 μg的乳剂200 μl注射在EAMG组大鼠后脚趾和颈背部皮下4点；首次接种后的第30 d及60 d用同样剂量的Rα97-116与不完全弗氏佐剂充分混匀后在实验鼠的臀部及靠近第1次注射部位的颈背部皮下强化接种，对照组同期皮下注射等量PBS共3次。接种前及接种后每周2次称量体质量，进行肌无力Lennon评分，分数越高，肌无力越重。　　1.2.3  低频重复电刺激检测 　　于第3次强化接种后第5 d，将大鼠以1％异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后仰卧固定，并将刺激电极插入坐骨神经附近肌肉内，参考电极插入腹部皮下，记录电极1根置于同侧腓肠肌内侧头，另1根插入跟腱部皮下，分别给予3 Hz和5 Hz 连续10次的低频重复电刺激，将第1与第5个动作电位变化的百分比作为衰减值D5，衰减率﹥10％者为低频重复电刺激试验阳性。　　1.2.4  CD28:CTLA4/B7检测 　　于第3次接种后第5 d，将大鼠断尾取肝素抗凝血50 μl，分别加入FITC-CD28、FITC-B7-2单克隆抗体各1 μl、PE-B7-1单克隆抗体2.5 μl、PE-CTLA4单克隆抗体10 μl，同型FITC-IgG、PE-IgG 1 μl为阴性对照，室温下避光孵育15 min，然后加入500 μl氯化铵红细胞裂解液溶血10 min，以1500 r/min离心5 min，取沉淀细胞加红细胞裂解液重复上述步骤再裂解1次，弃上清液，加入PBS 2 ml重悬细胞，洗涤2次，再加入500 μl PBS，震荡混匀，4℃避光保存，30 min内流式细胞仪检测。采用不同门控条件检测CD28、B7-1、B7-2、CTLA4在外周血和淋巴细胞、单核细胞中的表达。　　1.2.5  血清AChR-Ab检测 　　于第3次强化接种后第8 d，将大鼠断尾取血1 ml，离心后留取血清，用50 μl Rα97-116（0.5 μg/ml溶解在pH 5.0 PBS溶液中）铺板，4℃过夜。PBS清洗，0.25%BSA封闭,加入50 μl血清（1∶3200），室温孵育2 h后分别加入辣根过氧化物酶标记兔抗大鼠IgG（1∶5000），室温下静置30 min后再加入底物显色，50 μl（2 mol/L） H2SO4终止反应。在酶标仪上测量450 nm的OD值，标本OD值/阴性对照OD值（P/N值）＞2.1为阳性。　　1.2.6  统计学方法 　　数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10.0 软件进行组间t检验。2  结  果　　2.1  EAMG制模情况 　　根据肌无力Lennon评分、低频重复电刺激和血清AChR-Ab检测，EAMG组9只大鼠（75％）表现有肌无力症状、低频重复电刺激电衰减阳性、血清AChR-Ab阳性；其中肌无力Lennon评分：4分1只，3分2只，2分4只，1分2只，平均1.67分。对照组中1只评分0.5分,其他均为0分。　　2.2  两组外周血CD28、CTLA4、B7-1、B7-2表达的比较 　　见表1。与对照组比较，EAMG组外周血CD28、B7-1、B7-2及CTLA4的表达显著增加（P<0.05～0.01）。表1  两组外周血CD28、CTLA4、B7-1、B7-2 表达比较（略）注：与对照组比较*P<0.05，△P<0.01　　2.3  两组淋巴细胞及单核细胞CD28、B7-1 、B7-2及CTLA4表达的比较 　　见表2。与对照组比较，EAMG组淋巴细胞上CD28、B7-1、B7-2、CTLA4表达显著增加（P<0.05～0.01）；单核细胞上B7-1 、B7-2表达显著增加（P<0.05～0.01）。表2  两组淋巴细胞 单核细胞CD28、CTLA4 、B7-1 、B7-2表达的比较（略）注：与对照组比较*P<0.05，△P<0.013  讨  论    采用AChR-Ab免疫制备的大鼠EAMG模型在临床表现和免疫机制上与人类MG极其相似，是目前研究MG较为理想的实验动物模型。本研究采用Rα97-116肽段免疫近交系Lewis鼠制作EAMG大鼠模型，成模率达75%。    目前的研究［5］发现，MG自身抗体的产生呈T细胞依赖性，AChR特异性T细胞的异常活化是启动MG自身免疫反应的关键。T细胞完全活化有赖于双重信号的作用，第一信号是T细胞受体（TCR）特异性识别，并结合于抗原递呈细胞（APC）表面的抗原肽；第二信号即共刺激信号是T细胞表面多种受体与APC上特异性配体结合，其中的CD28:CTLA4/B7是最重要的共刺激分子，主要与T细胞活化、增殖及凋亡有关［6］，如没有共刺激信号参与，即使TCR特异性识别并与APC表面的抗原肽结合，也不能诱导产生T细胞活化，而导致T细胞失能或凋亡。    CD28及CTLA4以单体或同源二聚体的形式存在于T细胞表面,是B7分子的天然配体。CD28几乎在所有CD4+ T细胞和大多数CD8+T细胞中表达。目前认为CD28可提供初始T细胞共刺激信号，以促进白介素（IL）-2形成、T细胞增殖，阻止细胞凋亡和无能诱导。CD28表达下调可能是自身反应性T细胞表达降低所致。CTLA4只在活化T细胞表面表达，而静止的T细胞并不表达。CTLA4通过参与诱导体内免疫耐受和抑制T细胞增殖而起负性调节作用。研究证实CD28基因敲除鼠无法被诱导成EAMG。MG患者CD28、CTLA4表达增加，CD28表达持续时间延长［7］；且EAMG经免疫耐受后，CD28和CTLA4的表达均下调， T细胞增殖反应受抑制和干扰素（IFN）-γ的产生［8］；应用CTLA4 抗体阻断后，可使T细胞重新增殖［9］。这些研究结果均表明CD28、CTLA4在EAMG发病机制中起着十分重要的作用。本研究发现，CD28、CTLA4在EAMG组外周血白细胞表达较对照组明显增高，尤以在淋巴细胞中表达显著增高，表明EAMG模型的免疫功能处于异常的活跃状态。    B7-1、B7-2属B7分子超家族成员，是CD28、CTLA4的配体。B7-2主要在树突细胞和单核细胞表达，这些细胞和B细胞活化时，B7-2表达即上调。B7-1仅在树突状细胞少量表达，但B细胞活化时能诱导其表达，B7-1、B7-2是APC上的重要共刺激分子，可向T细胞传递十分重要的共刺激信号，所以当机体 B7-1和B7-2表达增多时有可能导致机体免疫耐受破坏，引起机体免疫功能紊乱。在诱导胸腺依赖抗原特异性免疫应答中，共刺激信号CD28/B7（B7-1或B7-2）是T细胞活化的重要因素之一，在免疫应答反应中起关键作用。有学者认为， B7-2介导的共刺激作用是激发T细胞反应的关键，而B7-1介导的共刺激作用可能是维持和扩延T细胞反应的必需。然而，在EAMG模型中B7-1和B7-2却具有相反的作用机制。Poussin等［10］研究发现，单独B7-1基因敲除鼠并不发生EAMG，而B7-2基因敲除鼠患病率为56%；表明B7-1共刺激分子在EAMG发病机制中起着重要作用，缺乏B7-1共刺激分子的参与，AChR介导的特异性T细胞异常活化不能激活。体外淋巴细胞增殖反应实验发现，用B7-1或B7-2抗体封闭EAMG鼠淋巴细胞后继续给予AChR刺激，结果两组大鼠的淋巴细胞增殖反应均明显受抑制，且以B7-2组抑制更为明显,说明B7-2共刺激分子在对AChR特异性淋巴细胞增殖反应中起主要作用，可能与MG病情持续与发展有关。本研究发现，B7-1和B7-2在EAMG大鼠外周血白细胞、淋巴细胞和单核细胞表达均较对照组明显增高，表明B7-1、B7-2在EAMG淋巴细胞、单核细胞表面均处于高表达状态，可能参与了MG的发生和病情进展。    总之，EAMG外周血淋巴细胞表达的CD28、CTLA4共刺激分子均处于高表达状态，它们可能与APC高表达的B7-1和B7-2结合从而激活T细胞活化、增殖和细胞因子分泌，导致MG自身免疫耐受机制障碍而产生异常的体液和细胞免疫反应。临床如何采用针对性阻断CD28:CTLA4/B7共刺激通路和抑制异常免疫反应，有望成为MG治疗的新思路。【参考文献】　　［1］吴怀国，陈荣志，许文华，等.乙酰胆碱受体α亚基125-147肽段制作实验性重症肌无力动物模型的研究［J］.临床神经病学杂志，2006，19：368.　　［2］Vermeiren J,Ceuppens JL,Haegel-Kronenberger H,et al. Blocking B7 and CD40 costimulatory molecules decrease antiviral T cell activity［J］.Clin Exp Immunol, 2004, 135:253.　　［3］毛海婷,王雄彪,张玲,等.CTLA4基因多态性在重症肌无力发病机理中的作用［J］.中华医学遗传学杂志,2004,21:574.　　［4］许文华，韩莹莹，汪思应,等.鼠源乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段免疫Lewis鼠诱导实验性重症肌无力模型［J］.中国神经精神疾病杂志，2006,32:179.　　［5］Lindstrom JM. Acetylcholine receptors and myasthenia ［J］. Muscle Nerve,2000,23:453.　　［6］Shape AH,Freeman GJ.The B7-CD28 superfamily［J］.Nat Rev Immunol,2002,2: 116.　　［7］韩钊，郑荣远，刘红雨,等.重症肌无力患者外周血B7:CD28/CTLA4共刺激分子表达的动态变化［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2003，23:203.　　［8］Maiti PK, Feferman T,Im SH,et al.Immunosuppression of rat myasthenia gravis by oral administration of a syngeneic acetylcholine receptor fragment［J］. Neuroimmunology，2004,152:112.　　［9］Paas-Rozner M,Sela M,Mozes E.A dual altered peptide ligand down-regulates myasthenogenic T cell responses by up-regulating CD25- and CTLA4-expressing CD4+ T cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:6676.　　［10］Poussin MA,Tuzun E,Goluszko E,et al.B7-1 costimulatory molecule is criticalfor the development of experimental autoimmune myasthenia gravis［J］.Immunology,2003, 170:4389.