细胞密度调节结肠癌细胞整合素ανβ6表达——癌细胞永生化侵袭生长机制的研究

作者：杨广运　徐克森　潘忠清　齐桂苓　陈融　王金申　寿楠海　牛军    作者单位：山东大学齐鲁医院肝胆外科　山东大学肝胆血管外科研究所　（山东　济南　250012）

【摘要】  目的：探讨细胞高密度和细胞挤压状态对结肠癌细胞表面整合素ανβ6表达的影响效果，探讨结肠癌细胞永生化侵袭生长的机制。方法：用流式细胞术检测结肠癌细胞系WiDr、SW480细胞株和人正常角质细胞系HaCaT细胞株，在高低密度培养条件下各细胞表面的ανβ6表达水平；同时将100例结肠癌标本高细胞密度易侵袭的肿瘤边缘部分及低细胞密度的肿瘤中心部分制作成200点的组织芯片，用免疫组织化学方法检测整合素ανβ6在结肠癌不同部位的分布和表达差异。结果：表达ανβ6的结肠癌细胞出现细胞密度依赖的ανβ6表达增加，而缺乏ανβ6表达的癌细胞和正常角质细胞系HaCaT细胞在高低密度培养条件下ανβ6表达没有改变。组织芯片免疫组织化学检查结果显示结肠癌ανβ6阳性表达率为38%，在癌细胞密度高、细胞拥挤的肿瘤边缘部分ανβ6高表达占73.7%（28/38），且ανβ6密布于肿瘤侵袭边缘，而肿瘤中央组织以ανβ6低表达为主，高表达仅占28.9%（11/38)。结论：细胞高密度和细胞挤压状态诱导癌细胞ανβ6表达可能是构成结肠癌细胞永生化侵袭性生长的基础。

【关键词】  结肠肿瘤· 整合素ανβ6·细胞密度·流式细胞术

    Cell density mediates integrin ανβ6 expression in colon cancer cells--A mechanism by which cancer cells sustain a self-perpetuating growth manner

    YANG Guang-yun1，2, XU Ke-sen1, PAN Zhong-qing2，QI Gui-ling2, CHEN Rong3, WANG Jin-shen1, SHOU Nan-hai1, NIU Jun1

    1Department of Hepatobiliary Surgery, Qilu Hospital, Shandong University and Institute of Hepatobiliary and Vascular Surgery, Shandong University （Jinan 250012 ，China）

    2Department of General Surgery，Qingzhou People's Hospital  （Qingzhou 262500, China）

    3Department of Pathophysiology, Medical College of Shandong University （Jinan 250012, China）

    【ABSTRACT】Objective: To detect the effect of cell density on integrin ανβ6 expression and the mechanism by which cancer cells sustain invasive growth via a self-perpetuating manner in colon cancer progression. Methods: Flow cytometry was applied to analyze ανβ6 expression in human colon cancer line, WiDr, SW480 cells and the normal human keratinocyte cell line, and HaCaT cells, respectively, at low and high cell density culture respectively. An immunohistochemical study of integrin ανβ6 was performed on tissue microarrays of 200 points/100 cases malignant colon specimens. Two cores were taken from each sample, one obtained from invasive tumor portions （tumor margin, especially cell crowding margin at high cell density）, the other obtained from non-invasive portions （centre tumor foci at low cell density）. Results: High cell density evidently enhanced integrin ανβ6 expression only for WiDr cells expressing ανβ6 compared with low density, but no increase was observed for both SW480 cells which lack ανβ6 and HaCaT cells. The ανβ6 expressive rate on immunoreactivity was 38% （38 in 100 cases）. High positive expression for ανβ6 on immunoreactivity was observed in invasive tumor edged portions in 73.7% （28/38） cases. In non-invasive centre tumor portions, low ανβ6 positive expressive was frequently observed and high ανβ6 expressive only seen in 28.9% （11/38） cases.  Conclusion: Cell crowding and dense induced integrin ανβ6 expression, which provided the basis for a self-perpetuating system of tumor invasive infiltrating growth in colon cancer progression.

    【KEY WORDS】Colonic neoplasms·Integrins ανβ6· Cell density·Flow cytometry

    　　癌细胞侵袭浸润性生长是恶性肿瘤区别于良性肿瘤的重要生物学特征［1］。癌细胞能克服正常细胞拥挤和密度积压障碍，穿透基底膜而无限制的侵袭浸润性生长，很可能与癌细胞表面整合素分子的表达和基质降解酶的分泌有关。本研究前期实验已证明ανβ6可调控MMP-9的分泌［２］；文献报道ανβ6是唯一仅存于恶性上皮性肿瘤组织的整合素亚型，在结肠癌生长的各个时期持续表达，在体内和体外均可促进结肠癌增殖和侵袭生长［３－６］。但是在人结肠癌侵袭生长过程中，细胞密度对整合素ανβ6表达的影响却未有文献报道。本研究通过观察细胞高密度和细胞挤压状态对结肠癌细胞表面整合素ανβ6表达的影响，探讨结肠癌细胞永生化侵袭浸润性生长的机制。

    1　材料与方法

    1.1　细胞株和试剂　人结肠癌细胞系WiDr、SW480细胞株及人胶质细胞系，HaCaT细胞株购自美国ATCC公司；抗ανβ6 整合素的单克隆抗体10D5购自美国Chemicon公司；抗整合素ανβ6的功能性单克隆抗体2G2购自美国Biogen公司；FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白IgG 和SP免疫组织化学试剂盒均购自深圳晶美公司。

    1.2　实验方法

    1.2.1　细胞培养　用人结肠癌细胞系WiDr wild和SW480 wild细胞株，进行低密度和高密度培养。将2.5 mL标准培养基加入到25 cm2的细胞培养瓶中，植入约7.5×105活细胞，进行低密度培养；在24孔组织培养板中植入相同数量的活细胞，进行高密度培养。细胞培养基每天更换1次。

    1.2.2　检测细胞表面整合素ανβ6的表达　用胰蛋白酶（Trypsin）/EDTA收集单层培养的细胞，羊血清在4°C下封闭10 min，PBS漂洗1次，抗β6的一抗E7P6 （10 μg/mL） 4°C孵化20 min，PBS漂洗2次，以标记藻红蛋白的二抗羊抗鼠IgG （60 μg/mL） 4°C染色 20 min，然后PBS漂洗2次，取0.5 mL PBS重悬液进行流式细胞术分析。测定各细胞表面ανβ6整合素的表达。

    1.2.3　组织芯片制备及免疫组织化学染色　随机选取山东大学齐鲁医院普外科2000年1月—2003年12月经病理组织学检查确诊的结肠癌存档蜡块100例。每个蜡块取两个点，一个取自高细胞密度的肿瘤侵袭生长的边缘部分（肿瘤浅表1/5），另一点取自低细胞密度的肿瘤中心部分（肿瘤中央2/5）。按照文献［７－８］描述的方法制备200点的组织芯片。组织芯片常规脱蜡水化；胃蛋白酶（pepsin）37℃抗原修复15 min，蒸馏水洗和PBS漂洗各2次，然后分别与抗ανβ6的一抗2G2 （1:1670稀释）、二抗及过氧化物酶标记的链霉素亲和素抗体孵育，以PBS代替一抗作为阴性对照，PBS水洗后DAB显色15 min，苏木精复染，封片观察。

    1.3　结果判定　ανβ6染色以细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，无阳性细胞记作0分，阳性细胞数≤25%记作1分，26%～50%记作2分，51%～75%记作3分，>75%记作4分；染色强度： 无染色记作0分，弱染色记作1分，中等强度染色记作2分，强染色记作3分。两者分值相加最后得分为判定标准：≤2分为阴性，3～7分为阳性（其中3～4分为阳性低表达，5～7分为阳性高表达）［9-11］。

    1.4　统计学处理　采用SPSS11.5软件进行统计分析，百分率比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

   2　结果

    2.1　WiDr细胞和SW480细胞表面整合素ανβ6的表达　与低密度培养相比，高密度培养的WiDr细胞ανβ6表达增加，而SW480细胞ανβ6表达没有细胞密度依赖的增加（图1）。

    2.2　细胞密度对人正常角化细胞ανβ6表达的影响　人正常表皮角化细胞在细胞培养条件下表达整合素ανβ6，HaCaT细胞在体内体外都表现一种单纯的正常生长分化模式［12－13］。将HaCaT细胞分别置于与WiDr细胞系完全相同的高、低密度条件下培养， 未观察到HaCaT细胞存在细胞密度依赖的ανβ6表达增加，见图1。

    2.3　结肠癌的边缘组织整合素ανβ6的表达　结肠癌边缘组织多见ανβ6高表达，表达率为73.7%（28/38），低表达仅为26.3％（10/38）,且ανβ6密布于肿瘤边缘；而肿瘤中央组织以ανβ6低表达为主，表达率为71.1％（27/38）,而高表达率仅占28.9%（11/38）。 ανβ6高表达率在肿瘤边缘与肿瘤中央差异有统计学意义（χ2 =15.2，Ｐ<0.01，图2）。

    3　讨论

    　　癌细胞能克服正常细胞拥挤和密度积压障碍穿过基底膜而无限制的永生化生长，从本质上反映了细胞表面问题，可能与黏附分子整合素有关。目前，关于结肠癌等人上皮源性恶性肿瘤、细胞密度对整合素等黏附分子表达程度的影响未有文献报道。有研究报道α3、α6和β1整合素亚型在人膀胱癌和结肠癌组织中观察到了细胞密度依赖性的表达变化［14］。另外，结肠癌调节细胞生长的基因表达已被证明是细胞密度依赖性的，结肠癌细胞人工培养至融合状态，转化生长因子TGF-β和血管内皮生长因子表达增加［15－16］。整合素ανβ6是唯一仅在恶性上皮性肿瘤组织表达，而在正常上皮组织及其他类型恶性肿瘤中不表达的一类特殊整合素亚型［3］。研究已证明在体内和体外ανβ6均可促进结肠癌细胞侵袭和生长［5－6］，且在侵袭生长的各个时期均持续表达［4］。与此相反，成人皮肤创伤愈合过程中，整合素ανβ6在角化细胞表达是短暂上调的，皮肤伤口愈合后10～28 d即恢复至受伤前的水平［17］；胎儿伤口愈合过程中，愈后3 d，伤口边缘的ανβ6表达随即消失［18］，提示ανβ6表达持续时间的区别反映了恶性细胞和正常细胞针对细胞挤压和细胞密度的改变存在着不同的生物学反应。本研究显示，高细胞密度培养选择性的提高了促生长整合素ανβ6在结肠癌细胞的表达，即在持续性表达ανβ6的WiDr细胞中，高细胞密度导致ανβ6表达的增加，而缺乏ανβ6表达的SW480细胞没有细胞密度依赖的ανβ6表达改变。具备正常角质细胞的生长分化模式的HaCaT细胞，也没有细胞密度依赖的ανβ6表达增加［12-13］。研究结果同时显示，至少在癌细胞表面，整合素ανβ6的表达呈密度依赖性增加的机制与正常细胞是不同的。癌细胞挤压和细胞密度增加诱导ανβ6表达增加，可能是癌细胞持续侵袭性生长的前提和启动子。

    　　为了证明ανβ6在人结肠癌标本不同部位的表达和分布程度，本研究分别取100例结肠癌标本的高细胞密度的肿瘤侵袭边缘组织和低细胞密度的肿瘤中央部位组织，制成组织芯片，进行ανβ6免疫组织化学染色。结果显示，ανβ6阳性表达的结肠癌中，73.7%的癌边缘组织ανβ6高表达，且密布于癌细胞岛的周边；肿瘤中央组织以ανβ6低表达为主，高表达率仅占28.9%。而良性结肠肿瘤无ανβ6表达［3－4］，提示癌细胞的相互挤压和高密度诱导了ανβ6的高表达，进一步促进了侵袭浸润性的癌细胞生长，说明癌细胞和正常细胞的ανβ6表达程度和生长机制均不同。文献报道，结肠上皮细胞从良性到恶性的转变过程中MMP-9表达增加［19］。结肠癌的边缘组织是癌细胞增殖最活跃的部位，也发现MMP-9的最大表达量［20］。该文献与本研究发现的ανβ6在肿瘤周边组织高表达的结果一致。此外已有研究证明，在结肠癌ανβ6诱导表达可增加MMP-9的分泌，并可促进MMP-9介导的癌细胞侵袭性生长［6］，用抗体封闭ανβ6的功能可导致MMP-9的活性丧失［21］，说明ανβ6的表达和MMP-9分泌是密切相关的，二者协同作用可促进结肠癌的侵袭性生长。

    　　总之，细胞挤压和细胞高密度诱导ανβ6表达与细胞永生化侵袭浸润性生长密切相关，ανβ6高表达又促进结肠癌的生长，进一步导致细胞拥挤和高密度，这一无限循环过程可解释部分结肠癌永生化侵袭性生长的现象。本研究表明，高细胞密度并不能导致ανβ6在人基底细胞系HaCaT细胞的表达增加，提示存在于癌细胞的ανβ6表达呈密度依赖性增加的机制对正常细胞是无效的。因此，根据高细胞密度诱导ανβ6表达的机制，可以针对结肠癌的不同特点，通过抑制ανβ6表达提出新的结肠癌治疗方案。

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